Targeted gene correction mediated by recombinant adeno-associated virus and DNA double strand breaks
Final Report Abstract
Die Fähigkeit gezielte Veränderungen in einem komplexen Säugergenom vorzunehmen, hat die biomedizinische Forschungslandschaft Ende der 1980er Jahre nachhaltig verändert. Anders als beim konventionellen Gentargeting, welches beispielsweise zur Generierung von Knockout-Mäusen angewendet wird, sollte im Rahmen dieses Forschungsprojekts eine Technologie weiterentwickelt werden, welche eine effektive und gezielte Genmodifikation ohne Einsatz von Selektionsmarkern zulässt. Grundlage dieser Technologie bilden künstliche Nukleasen, welche eine bestimmte Sequenz im Genom erkennen und nach Einführen eines DNA-Doppelstrangbruchs zelluläre Reparaturprozesse aktivieren, welche den DNA-Schaden unter zu Hilfenahme einer Reparaturvorlage über homologe Rekombination (HR) reparieren. Zinkfingernukleasen (ZFN) sind die bislang erfolgreichste Klasse von künstlichen Endonukleasen und bestehen aus einer spezifischen DNA-Bindungsdomäne und einer unspezifischen Endonukleasedomäne. Es ist uns während der Förderperiode gelungen ZFN herzustellen, welche effektiv eine chromosomale Zielsequenz im menschlichen Genom erkennen und schneiden. Toxizität, welche durch unspezifische Aktivität der ZFN ausgelöst wurde, war lange Zeit ein limitierender Faktor beim Einsatz von ZFN. Mit Hilfe einer computer-gestützten Neugestaltung der Nukleasedomäne und einer kombinatorischen In-vivo-Affinitätsreifung der DNA-Bindungsdomäne, konnte die Spezifität der ZFN signifikant erhöht werden, was zu einer deutlichen Verbesserung der Aktivität und gleichzeitiger Reduktion der Toxizität führte. Die systematische Optimierung des ZFN-Designs stellt somit eine signifikante Verbesserung des Sicherheitsprofils dieser künstlichen Nukleasen dar und ist eine wichtige Basis für die geplanten therapeutischen Anwendungen dieser Technologie. Das effektive gleichzeitige Einschleusen der ZFN und einer Reparaturvorlage für die HR ist entscheidend für den Erfolg einer In-vivo- oder Ex-vivo-Genmodifikation in den Zielzellen. Wie vor einigen Jahren gezeigt, eignen sich insbesondere Virusvektoren auf der Basis von Adeno-assoziierten Viren (AAV) für diesen Zweck. Durch die von uns vorangetriebene Weiterentwicklung des MV-Vektorsystems für den Einsatz im Gentargeting, können wir mittlerweile ein chromosomal vorliegendes Markergen in bis zu 70% einer Zelllinie korrigieren. Zeitnah soll getestet werden, ob gezielte genetische Veränderungen auch in adulten Stammzellen ex vivo möglich sind. Die Kombination der Gen- und Stammzelltherapie ist ein besonders viel versprechender Ansatz zur Behandlung von Erbkrankheiten, der in Verbindung mit der ZFN-Technologie erweitert werden kann, um neue Therapieoptionen für angeborene und erworbene Krankheiten zu schaffen.
Publications
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