Structural and kinetic analysis of the functional complex between protein tyrosine phosphatase SL (PTP-SL) and Erk2 MAP kinase
Final Report Abstract
Wir haben insgesamt neun verschiedene Konstrukte von PTP-SL hergestellt (Variation in Länge und Sequenz) und deren Eigenschaften für die Komplexbildung mit ERK2 untersucht. Die aktive, an Thr183 und Tyr185 phosphorylierte Form von ERK2 wurde durch Phosphorylierung mit MKK hergestellt. Die stabilen binären Komplexe zwischen den verschiedenen Proteinen wurden in über 4000 Kristallisationsexperimenten zur Kristallisation angesetzt. Bislang ist es jedoch nicht gelungen, Kristalle zu züchten, die eine Röntgenstrukturanalyse ermöglicht hätten. Für eine weitere Analyse des binären Komplexes aus ERK2 und PTP-SL haben wir chemische Quervernetzung der Proteine durchgeführt. Mit Hilfe dieser chemischer Quervernetzung, partieller Proteolyse und Massenspektrometrie der Peptidfragmente ist es uns gelungen, das wechselwirkende Epitop zwischen aktiviertem ERK2 und PTP-SL näher einzugrenzen und ein mögliches Modell des binären Komplexes mittels MD-Simulation zu berechnen. Die ERK2-katalysierte Phosphorylierung an Thr253 von PTP-SL konnte durchgeführt werden. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass dieser Proteinkomplex extrem stabil ist, und die Trennung von ERK2 und PTP-SL(pThr253) nicht effizient und quantitativ durchgeführt werden konnte. Die zellbiologische Bedeutung dieses Befundes wird derzeit näher untersucht. Unsere kinetischen Analysen ergaben, dass die KIM-Region und die N-terminale Region insgesamt die katalytische Effizienz von der Phosphataseaktivität von PTP-SL erhöhen. Ob die Phosphorylierung an Thr253 aber ebenfalls einen Einfluss hat, konnten wir bislang nicht überprüfen, da eine effiziente Aufreinigung von PTP-SL(pThr253) noch nicht erzielt werden konnte.
