Zeitaufgelöste Darstellung des Zelleintritts und der frühen Infektion von HIV-1 an lebenden Zellen mittels Single Virus Tracing
Final Report Abstract
Zielsetzung des Projektes war die mikroskopische zeitaufgelöste Analyse des HIV-Zelleintritts. Der Gutachterempfehlung folgend haben wir uns auf die Projektteile ‚Lebendzellmikroskopie des HIV-Zelleintritts‘, sowie ‚Verbesserte fluoreszenzmarkierte HIV Derivate‘ konzentriert. Die Untersuchung des HIV Env vermittelten Zelleintritts in HeLa-abgeleitete Modellzellen erwies sich aufgrund des hohen Anteils unspezifischer Virusbindung und Aufnahme als nicht erfolgversprechend. Daher wurde die Dynamik des retroviralen Zelleintritts an HIV/MLV Pseudotypen charakterisiert, die eine hohe Fusogenität an der Plasmamembran aufweisen. Der Zelleintritt von HIV Env tragenden Partikeln wurde an einer physiologisch relevanteren T-Zell-Linie untersucht, an der ein hoher Anteil Env-CD4 spezifischer Virusbindung festgestellt wurde. Ein wesentlicher Teil des produktiven Eintritts in diese Zellen erfolgte über endozytotische Aufnahme von HIV in Aktin-assoziierte Vesikel. Diese Untersuchungen werden fortgesetzt. Wesentliche Ergebnisse des zweiten Projektteils waren die Herstellung und Charakterisierung optimaler fluoreszierender Marker für die virale Lipidhülle (FP.TM bzw. FP.SNAP) und das Virusinnere (Vpr.IN.eGFP), sowie die Herstellung und Charakterisierung eines infektiösen HIV Derivates, das spezifische Markierung von HIV Partikeln oder HIV Gag in virusproduzierenden Zellen mit synthetischen Fluoreszenzfarbstoffen erlaubt. Die im Rahmen des Projektes etablierten HIV-Derivate, mikroskopischen Methoden und Tracking-Algorithmen erlaubten es uns, bei der Lebendzellanalyse der HIV-Zell-Interaktion auch späte Schritte des viralen Replikationszyklus einzubeziehen. In Zusammenarbeit mit der Gruppe von D. Lamb (LMU München) wurde die Kinetik des HIV Assembly-Prozesses an der Zellmembran analysiert und die Rekrutierung des für die Virusfreisetzung essentiellen Wirtsfaktors VPS4 untersucht. Ergebnisse dieser Arbeiten wurden auch der breiteren Öffentlichkeit zugänglich gemacht (z.B. aerzteblatt.de, März 2011). Sie bilden die Grundlage für weiterführende Untersuchungen zur Rolle zellulärer Faktoren in HIV-Partikelbildung und -Freisetzung.
Publications
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(2008). HIV-1-cellular interactions analyzed by single virus tracing. Eur Biophys J 37, 1291-1301
Endress, T., Lampe, M., Briggs, J.A., Kräusslich, H.G., Bräuchle, C., Müller, B., and Lamb, D.C.
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(2009). Deterministic and probabilistic approaches for tracking virus particles in time-lapse fluorescence microscopy image sequences. Medical image analysis 13, 325-342
Godinez, W.J., Lampe, M., Wörz, S., Müller, B., Eils, R., and Rohr, K.
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(2009). Dynamics of HIV-1 assembly and release. PLoS pathogens 5, e1000652
Ivanchenko, S., Godinez, W.J., Lampe, M., Kräusslich, H.G., Eils, R., Rohr, K., Bräuchle, C., Müller, B., and Lamb, D.C.
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(2009). Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy. Retrovirology 6, 84
Koch, P., Lampe, M., Godinez, W.J., Müller, B., Rohr, K., Kräusslich, H.G., and Lehmann, M.J.
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(2011). Live-cell visualization of dynamics of HIV budding site interactions with an ESCRT component. Nature cell biology 13, 469-474
Baumgärtel, V., Ivanchenko, S., Dupont, A., Sergeev, M., Wiseman, P.W., Kräusslich, H.G., Bräuchle, C., Müller, B., and Lamb, D.C.
