Lysosomale Sphingomyelinase und Ceramidase: Strukturaufklärung, Pathobiochemie von Sphingolipidosen und Signaltransduktion
Final Report Abstract
Die saure Sphingomyelinase und die saure Ceramidase sind lysosomale Hydrolasen, wobei erstere den lysosomalen Abbau von Sphingomyelin zu Ceramid und Phosphorylcholin und letztere die Spaltung von Ceramid zu Sphingosin und freier Fettsäure katalysiert. Defekte in den Genen dieser Hydrolasen führen zur lysosomalen Akkumulation von Sphingomyelin bzw. Ceramid bei der Niemann-Pick'schen bzw. der Farber'sehen Krankheit. Die permante RNA Interferenz in somatischen Säugerzellen gelang im Rahmen dieses Projektes für die saure Ceramidase und die saure Sphingomyelinase in HeLa-Zellen, sowie für die neutrale Ceramidase in Rattenfibroblaten. Allerdings zeigten die Zellinien einen sehr unterschiedlich stark ausgeprägten Knockdown der entsprechenden Enzyme und, wenn überhaupt nur einen sehr geringen Einfluss auf die Lipidkonzentrationen. Nebeneffekte der RNA-Interferenz Methode können nicht ausgeschlossen werden. Es wurde eine Methode entwickelt, im präparativen Mastab homogene, reife saure Ceramidase herzustellen und effektiv zu reinigen. Mit Hilfe von massenspektrometrischen und proteinchemischen Methoden wurde die Oligosaccharidstruktur und die Lage der Disulfid-Brücken identifiziert (Schulze et al. 2007). Die Röntgenstrukturanalyse des Enzyms ist noch nicht abgeschlossen. Versuche den enzymatisch inaktiven Vorläufer des Enzyms zu isolieren schlugen zunächst fehl, daher wurden zwei spaltungsresistente Varianten des Enzyms hergestellt. Auch von diesen Varianten wird die Röntgenstrukturanalyse angestrebt. In Kooperation wurde gezeigt, dass eine Überexpression der sauren Ceramidase eine Hemmung des Insulinrezeptor-Signalwegs durch gesättigte Fettsäuren und Ceramid verhindert (Chavez et al., 2005). Die Untersuchung von 25 Patienten der Niemann-Pick'sehen Erkrankung auf klinischer, biochemischer und genetischer Ebene ließ einen Zusammenhang zwischen klinischer
Publications
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Chavez JA, Holland WL, Bär J, Sandhoff K und Summers SA (2005) Acid Ceramidaeoverexpression prevents the inhibitory effects of saturated fatty acids on insulin signaling J.Biol.Chem. 280, 20148-53.
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Pavlü-Pereira H, Asfaw B, Poupctova H, Ledvinova J, Sikora J, Vanier MT, Sandhoff K, Zeman J, Novotna Z, Chudoba D und Elleder M (2005) Acid Sphingomyelinase deficiency. Phenotype variability with prevalence of intermediate phenotype in a series of twenty-five Czech and Slovak patients. A multi-approach study. J. Inherit. Metab. Dis. 28, 203-27
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Schulze H, Schepers U und Sandhoff K (2007) Overexpression and mass spectrometry analysis of mature human acid ceramidase. Biol. Chem. 388, 1333-43
