Untersuchungen zur Rezeptor-Ligand Interaktion mit Hilfe neuer single chain TNF-Derivate
Final Report Abstract
Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) ist ein Schlüsselzytokin des angeborenen Immunsystems. TNF liegt in seiner biologisch aktiven Form als nicht-kovalent gebundenes Homotrimer vor und bindet an zwei Membranrezeptoren, TNFRl und TNFR2, wobei die eigentliche Signalinitiierung primär durch eine Trimerisierung der jeweiligen Rezeptoren vermittelt wird. Wir haben TNF-Derivate konstruiert, bei denen die drei TNF Monomere eines Moleküls über kurze Peptidlinker miteinander verbunden sind (single chain TNF; scTNF). scTNF zeigt in vitro und in vivo die Bioaktivität von wildtyp TNF. Basierend auf den kovalent verknüpften scTNF-Molekülen konnten wir erstmals weitere Derivate herstellen, bei denen einzelne Rezeptorbindestellen des Liganden inaktiviert sind. Funktionell gesehen stehen uns damit wildtyp-TNF-ähnliche „3-wertige" scTNF Moleküle zur Verfügung, aber auch „2-wertige" und „1-wertige" Derivate. Im vorliegenden Projekt wurden diese Moleküle verwendet um Aussagen über die Stöchiometrie der Initialen Ligand/Rezeptorinteraktion zu erhalten. Dazu wurden die produzierten und angereinigten scTNF-Varianten bezüglich ihrer Bioaktivität verglichen, und es wurden ihre Affinitäten nach einer Markierung, mit radioaktivem lod in Gleichgewichtsbindungsstudien bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse weisen eindeutig nach, dass bereits bei der Initialen Interaktion des Liganden mit zellulären Membranrezeptoren kooperative Effekte stattfinden, d.h. mehr als ein einziger Rezeptor bindet das Ligandenmolekül. Dies belegt klar, dass in Übereinstimmung mit der sog. PLAD-Hypothese die TNF-Rezeptoren in unligiertem Zustand nicht als Monomere auf der Zelloberfläche vorliegen, sondern als höhere Multimere. In sich sehr konsistent (jedoch im Widerspruch zu Literaturdaten) weisen dabei die eigenen Daten sehr stark auf Homodimere von TNFR1 hin. Die erhaltenen Ergebnisse mit TNFR2 lassen sich jedoch eher mit der Existenz von Homotrimeren erklären (oder noch höheren Multimeren, z.B. auch der Existenz von in Clustern angereicherten TNFR2-Molekülen). Dieser Unterschied zwischen den beiden TNF-Rezeptoren ist unerwartet, hochinteressant, erfordert jedoch noch eine weitere Bearbeitung.
Publications
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Single-chain TNF, a TNF derivative with enhanced stability and antitumoral activity. J Immunol. 180 (2008) 8176-8183
Krippner-Heidenreich A, Grunwald I, Zimmermann G, Kühnle M, Gerspach J, Sterns T, Shnyder SD, Gill JH, Männel DN, Pfizenmaier K, Scheurich P
