Foamy Virus Replication: Structure-function analysis of viral enzymes involved in generating genetic diversity or in conserving the genome
Final Report Abstract
Unsere Arbeiten zur Charakterisierung des Gag-Proteins sowie der Enzyme PR, RT und RNase H von FV ergaben viele neue und einzigartige Unterschiede zu den entsprechenden Enzymen von Orthoretroviren. Die freie FV PR ist ein Monomer, ebenso liegt das PR-RT Enzym als Monomer vor. Wir konnten einen einzigartigen Mechanismus der PR-Aktivierung zeigen, bei dem die PR-RT an eine spezifische Region (PARM) der viralen RNA bindet. Erst dadurch können die PR-Domänen von zwei PR-RTs dimerisieren, d.h. die FV PR wird indirekt durch RNA aktiviert. Dies ist bei Orthoretroviren und bisher bekannten zellulären PRs nicht der Fall. Es zeigte sich, dass die Sekundärstruktur der PARM-RNA für die Aktivierung wichtig ist. Wir konnten zeigen, dass der Zeitpunkt der Reverse Transkription bei FV von der Gag- Prozessierung abhängig ist. Damit reguliert die PR-Aktivität den Beginn der RT-Reaktion. Außerdem konnten wir die dreidimensionale Struktur der PFV RNase H in Lösung mittels NMR-Analyse lösen. Dadurch waren wir auch in der Lage die Funktion der sog. basic protrusion zu erklären. Die RNase H Struktur war die Grundlage für ein neues Projekt mit der Arbeitsgruppe von Prof. Enzo Tramontano (Cagliari), in dem wir HIV-1 RNase H Inhibitoren mit PFV RNase H testeten, um die Bindungsregion der Inhibitoren zu identifizieren. Strukturvergleiche führten zur Identifikation der entsprechenden Reste in der HIV-1 RNase H. Unsere gemeinsamen Untersuchungen zur gag-Expression führten zur Aufklärung der Regulation der Polyadenylierung in FV. Weiterhin gelang es uns innerhalb dieses Projektes den einzigartigen RNA-Exportweg von FV aufzuklären. Kristallisationsversuche mit der SFV RT führten zu Kristallen mit zu geringer Auflösung, um die Struktur lösen zu können. Allerdings konnten wir den molekularen Mechanismus der AZT-Resistenz bei SFV weiter aufklären. Vier Aminosäureaustausche in der Polymerasedomäne führen bei SFV zur Resistenz, wobei der Austausch S345T essenziell ist und die Bindung von ATP ermöglicht, welches für den Ausbau des bereits inkorporierten AZTMPs erforderlich ist. Dies konnten wir u.a. mit Hilfe von NMR-Analysen mit der verkürzten Wildtyp RT und mit der resistenten Vierfachvariante zeigen. Das erworbene Wissen und die entwickelten Techniken wurden erfolgreich in neue Projekte zur Untersuchung der Dengue-Virus und HIV-1 PR transferiert. Insgesamt war die enge Zusammenarbeit beider Arbeitsgruppen sehr wertvoll und essenziell, da es uns ermöglichte, in vitro Daten mit den entsprechenden in vivo Ergebnissen zu vergleichen. Auch wurden in Projekten beider Arbeitsgruppen technische Fähigkeiten der anderen Gruppe genutzt.
Publications
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