Biochemische Charakterisierung der Glycosyltransferase WbpL von Pseudomonas aeruginosa als potentielles Target für neue Antiinfektiva
Final Report Abstract
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass alle Arbeitsschritte mit WbpL (Klonierungen, Transformationen, Expressionen) vermutlich aufgrund der 11 Transmembrandomänen zeitaufwendig und wiederholungsintensiv sind. MBP-WbpL und MBP-WbpL-EGFP können unter dem Rhamnose-induzierbaren Promotor rhaP in E. co// XLIBlue hergestellt, als lösliches Protein über Affinitätschromatographie aufgereinigt und durch fällung bei 30-40% Ammoniumsulfat-Sättigung von anderen Proteinen im Eluat weitgehend abgetrennt werden. Aufgrund der starken hydrophoben Eigenschaften von WbpL binden die Fusionsproteine wahrscheinlich unspezifisch an verschiedene Matrices, wodurch es bei einigen Reinigungsschritten verloren geht. Durch Dialyse des Proteins mit OPG und POPC können Proteoliposomen gewonnen werden. Im Aktivitätsassay konnte bislang durch starke Schwankungen der Ergebnisse kein klares Bild über einen möglichen Aktivitätsnachweis erbracht werden. Nach optischer Beurteilung ist 10% CHAPS als einziges Detergenz zur Vermittlung der Löslichkeit des Substrates Undecaprenylphosphat geeignet. Mit UDP-N-acetyl-D-galactosamin konnte keine Aktivität nachgewiesen werden. Die mit UDP-N-acetyl-D-glucosamin gefundene Aktivität in Membranfraktionen ist als unspezifische Hintergrundaktivität einzustufen. Die etwas höhere Aktivität der Membranfraktionen der Überexpressionsstämme im Vergleich zum Expressionsstamm mit leerem Vektor könnte ein Hinweis auf spezifische Aktivität sein. Daher ist es dringend erforderlich, für den Aktivitätsnachweis das Protein in gereinigter Form zu verwenden. Erste Messungen mit MBP-WbpL-Liposomen, sowie MBP-WbpL nach 30% Ammoniumsulfatfällung mit zum Teil erkennbaren Proteinaggregaten im HEPES-Puffer-System ergaben für die butanollöslichen Fraktionen 2-3-fache cpm-Werte gegenüber den Leerliposomen. Kein erkennbarer Unterschied besteht aber zwischen Proben mit und ohne Undecaprenylphosphat. Weitere Tests, sowie die Herstellung von weiteren Proteoliposomen als Negativkontrolle sind daher erforderlich.
Publications
- RAMM M, WQLFENDER JL, QUEIROZ EF, HOSTETTMANN K, HAMBURGER M (2004) Rapid analysis of nucleotide-activated sugars by high-performance liquid chromatography coupled with diodearray detection, electrospray ionization mass spectrometry and nuclear magnetic resonance. J ChromatogrA. 1034(1-2), 139-148.
