Signalstrukturen der enteroviralen Replikation und Translation: Interaktion des humanen Poly(rC)-bindenden Proteins 2 mit Enterovirus-RNA
Final Report Abstract
Die 5'-nichttranslatierte Region (5'-NTR) des enteroviralen Positivstrang-RNA-Genoms trägt Signalstrukturen für die Initiation der Replikation und der cap-unabhängigen Translation. Diese RNA-Strukturen sind an Interaktionen mit zellulären und viralen Proteinen beteiligt. Die Bindung des humanen Poly(rC)-bindenden Proteins 2 (PCBP2) an die RNA-Domäne IV der 5'-NTR ist essentiell für die Translationsinitiation, während die Bindung an Stemloop B des Cloverleafs (l/B) die Replikation viraler RNA ermöglicht. Ziel des Teilprojekts 1 war die Charakterisierung dieser RNA-PCBP2-lnteraktionen durch In-vitro-Bindungsstudien unter Venwendung von rekombinantem PCBP2 bzw. seiner RNA-bindenden Subdomänen und in-vitro-transkribierter Coxsackievirus B3 (CVB3) RNAs, die den Signalstrukturen entsprechen. Daneben sollten Experimente zur biologischen Signifikanz dieser Interaktionen durchgeführt werden. Die Interaktionen des PCBP und seiner RNA-bindenden Subdomänen KH1 und KH3 mit Cloverleaf (CL) RNA und mutierter RNA wurden biochemisch durch Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSAs) und Filterbindungs-Assays charakterisiert. Dabei wurde ein Oligo(rC)-Trakt (nt. 90 - 105) als neue PCBP-Bindungsstelle identifiziert und ebenfalls charakterisiert. Die KHI-Domäne des PCBP2 bindet RNA in Abhängigkeit von der getesteten Variante etwa 4 - 18fach besser als die KH3-Domäne, dennoch ließen sich auch hier erstmals stabile CL/KH3-Komplexe darstellen. Transfektionsexperimente mit CVB3-Replikon-RNAs, die zwar die Replikation ermöglichen, aber nicht die Generierung infektiöser Viruspartikel erlauben, zeigen, daß sowohl die Mutation der PCBP2-Bindungsstelle im Stemloop 1/B als auch die Mutation des Oligo(rC)-Traktes die Replikation der viralen RNA beeinträchtigen. Durch Deletion der 3D-Polymerasegenregion im viralen Genom konnte nachgewiesen werden, daß das Vorhandensein intakter PCBP2-Bindungsstellen auch die Effizienz der cap-unabhängigen Transiationsinitiation positiv beeinflusst. Insgesamt sieben Mutationen wurden durch Transfektionsexperimente auf ihre Fähigkeit geprüft, die Bildung Infektiöser Partikel zu induzieren. Fünf Mutanten erwiesen sich dabei als vital, vier Mutanten zeigten schon nach wenigen Passagen Reversionen der eingeführten Mutationen, was als Hinweis auf die Bedeutung intakter PCBP2-Bindungsstellen für die Replikation von CVB3 angesehen werden kann. Interessant ist die Lebensfähigkeit einer Doppelmutante mit Mutation der l/B-Bindungsstelle und Deletion des Ollgo(rC)-Traktes. Sie vermehrt sich nur sehr langsam, zeigt aber auch nach 10 Passagen keine Reversionen. Obwohl die Interaktion des PCBP2 mit diesen Bindungsstellen als essentiell für die Replikation angesehen werden, zeigt die Lebensfähigkeit dieser Mutante, daß es eine alternative Replikationsinitiation geben muß.
Publications
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2007. RNA interaction and cleavage of poly(C)-binding protein 2 by hepatitis A virus protease. Biochem Biophys Res Commun 364(4):725-730, Epub 2007 Oct 15
Zhang B, Seitz S, Kusov Y, Zell R, Gauss-Müller V.
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2008. Interaction of poly(rC)-binding protein 2 domains KH1 and KH3 with coxsackievirus RNA. Biochem Biophys Res Comm
Zell R, Ihle Y, Effenberger M, Seitz S, Wutzler P, Görlach M
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2008. Poly(rC)-binding protein 2 interacts with the oligo(rC) tract of coxsackievirus B3. Biochem Biophys Res Commun 366(4);917-921
Zell R, Ihle Y, Seitz S, Gündel U, Wutzler P, Görlach M
