Entwicklung eines in vitro-Modellsystems zur Untersuchung der Penetrationskompetenz pflanzenpathogener Pilze
Final Report Abstract
Auf der Basis der Charakterisierung von Blattoberflächen konnten freitragende, hydrophobe und inerte Dünnschichtmembranen hergestellt und erfolgreich zur Durchfuhrung von Penetrationsexperimenten eingesetzt werden. Die Durchführung von Penetrationsexperimenten an freitragenden, inerten Membranen war zum Zeitpunkt der Antragstellung nur in wenigen Voruntersuchungen getestet worden; Experimente mit freitragenden Membranen mit Dicken im Bereich um 100 nm und darunter sind in der Literatur nicht bekannt. Diese Experimente, die die Beurteilung der Penetrationskraft ohne die Beteiligung Cutin- und Zellwand-abbauender Enzyme erlauben, konnten im Verlauf des Projektes soweit entwickelt werden, dass Untersuchungen mit verschiedenen phytopathogenen Pilzen durchgeführt werden konnte. Auf der Basis dieser Ergebnisse konnte ein in vitro-Modell entwickelt werden. Die Untersuchungen mit Pilzen, die sich bezüglich der Melanisierung und Ausprägung ihrer Appressorien unterscheiden, wurden von einem der Gutachter angeregt. Das unerwartete Ergebnis dieser Untersuchungen war, dass Pilze mit nicht-melanisierten Appressorien, z.B. der Sojabohnenrost Phakopsora pachyrhizi und Cochliobolus carbonum, inerte Membranen mit höherer Effizienz penetrieren als Colletotrichum graminicola. Aus diesem Grund wurden mittels homologer Rekombination Polyketid Synthase-defiziente Isolate {ACgpksl) von C. graminicola hergestellt und hinsichtlich ihrer Penetrationskompetenz mit dem Wildtypisolat verglichen. Unsere Daten zeigen, dass die Melanisierung von Appressorien für die Generierung von Turgordruck und den Penetrationserfolg auf inerten dünnen Schichten nicht erforderlich ist und stehen im Gegensatz zu den Dogmen der phytopathologischen Literatur. Der experimentelle Umgang mit freitragenden Membranen mit Dicken im Bereich um 100 nm und darunter (angelehnt an Dicken von Pflanzenepidermen), sowie die Durchführung dieser oder ähnlicher biomechanischer Untersuchungen sind in der Literatur nicht bekannt und erwiesen sich als herausfordernde Aufgabe. Unsere Untersuchungen haben die Abhängigkeit der Penetrationskompetenz von der Dicke der Membran bestätigt. Die Fähigkeit, inerte Schichten zu penetrieren, unterschied sich bei den verschiedenen getesteten Pathogenen. Den Erwartungen entsprechend zeigte Magnaporthe oryzae die höchste Penetrationskompetenz auf inerten Schichten. Im Rahmen dieser Untersuchungen wurden neue Fragen hinsichtlich der Penetrationskompetenz von Pathogenen mit nicht-melanisierten Appressorien aufgeworfen. Durch das neu entwickelte in vitro Modell konnten neue Ansätze gefunden werden, die in künftigen Untersuchungen zu klären sind. Um Gene zu identifizieren, die bei der Kraftpenetrarion eine Rolle spielen, wurde in Ergänzung der Penetrationsexperimcnle mit unterschiedlichen Pilzen und definierten Melanin-defizienten Mutanten durch Agrobacterium tumefaciens-vermitteXte Transformation Zufallsmutanten von C. graminicola erzeugt. Mutanten, die während eines Screens auf Maisblattsegmenten keine oder nur sehr schwache Symptome zeigten, wurden mikroskopisch auf Maisblättern und PTFE- und PMMA-Dünnschichtmembranen charakterisiert. Es wurde versucht, den Penetrationsvorgang experimentell und numerisch zu simulieren. Wir konnten einen Versuchsaufbau realisieren, mit dem es möglich war, das Versagen der PTFE-Membran bei Belastung, angelehnt an die geometrischen Verhältnisse der Phytopathogene, mittels eines Nanoindentors zu simulieren. Zur numerischen Simularion der Penetrarion wurde ein 3D-Modell entwickelt, bei dem ein Eindringkörper (Penetrationshyphe) eine Membran (Zellwand) durchdringt, und mit diversen Annahmen angewendet. Um das Verhalten genau simulieren zu können, wurden Materialparameter mittels Nanoindentation bestimmt. Mögliche Anwendungen, die sich nach Ablauf des Projektes ergeben können, zielen auf Tests zur Bewertung verschiedener Phytopathoge. Mit einem neu entwickelten, relativ wenig störanfälligen und gut reproduzierbaren in vitro-System ließen sich beispielsweise große Umfänge von Kandidatensubstanzen im Rahmen von anti-Penetrations Fungizid-Screening-Programmen testen, was zu einer aus ökologischer und ökonomischer Sicht verbesserten Fungizid Entwicklung führen könnte.
Publications
- (2006). Determinants of the penetration competence of Colletotrichum graminicola. Mitt. Biol. Bundesanst. Land- und Forstwirtschaft Berlin-Dahlem 400, 254
Eichler, N., Horbach, R., Floss, D. Küster, S., Kiesow, A., Deising, H.B
- Determinanten der Penetrationskompetenz bei Colletotrichum graminicola. 55. Deutschen Pflanzenschutztagung, Göttingen, 25. - 28. September 2006, Vortrag
Nancy Eichler, Ralf Horbach, Daniela Floss, Stefan Küster, Andreas Kiesow, Holger B. Deising
- Entwicklung eines in vitro-Versuchsmodellsystems zur Untersuchung der Penetrationskompetenz pflanzenpathogener Pilze. Beitrag zum Jahresbericht 2007 des Fraunhofer-lnstituts fiir Werkstoffmechanik
S. Küster, A. Kiesow
- PTFE-like membranes used as implements for an in vitro modelling system of plant pathogenesis. 13. Intemational Conference of Polymeric Materials 2008, Halle, Germany 24.-26.9.2008. Poster
Küster, S., Kiesow, A., Ludwig, N., Deising, H.B.
- Thin PTFE-like membranes allow characterizing germination and mechanical penetration competence of pathogenic fungi. Acta Biomaterialia (2008) 4: 1809-1818
Küster, S.; Ludwig, N.; Willers, G.; Hoffmann, J.; Deising, H. B.; Kiesow, A.
