Optimierung der Sektretion von rekombinanten Proteinen aus Escherichia coli durch Analyse der Genexpression
Final Report Abstract
Zu Beginn des Projektes wurde versucht optimale Untersuchungsstämme zu konstruieren. Dazu war es notwendig einerseits ein brauchbares Induktionssystem für das Bacteriocin Release Proteins (BRP) zu etablieren und andererseits Reporterproteine für die Sekretion in das Medium zu etablieren. Mit dem Anspruch Reporterproteine sowohl mit dem See- als auch mit dem TAT-Pfad zu transportieren, wurden verschiedene Proteine dahingehend untersucht, ob sie mit beiden Pfaden transportiert werden. Ein weiteres wichtiges Kriterium war eine einfache Quantifizierung der Reporterproteine. Die eigentlichen Untersuchungen zur Sekretion mittels des BRP dessen Auswirkungen auf die Genexpression wurden mit der ß-Lactamase und der alkalischen Phosphatase und nur mit dem See-Pfad durchgeführt. Es wurden zwei häufig verwendete BRP des Colicins E1 und des Cloacins DF13 sowie zwei modifizierte Varianten des Cloacin DF13 BRPs, LppBRP und LppBRP-His6, vorab auf ihre Wirkung untersucht wobei sich herausstellte, dass die sekretionsfördernde Eigenschaften dieser vier BRP vergleichbar waren. Da die Toxizität für E. coli bei LppBRP am gering war, wurde LppBRP-Hise verwendet, was eine Detektion über Hise-Antikörper ermöglicht. Damit konnte nachgewiesen werden, dass BRP als Protein bereits zwei Minuten nach Induktion in der Zelle vorhanden ist Neben diesen Untersuchungen wurden zur Verbesserung der Proteinsekretion insbesondere prozesstechnische Ansätze verfolgt, welche sich auf die Steuerung der BRP-Coexpression durch entsprechende Induktionsstrategien fokussierten. Der Einsatz des Arabinose-regulierbaren pBAD-Promotors erwies sich als besser geeignet als der IPTG induzierte lacUV5 Promotor um die LppBRP-Expression zu steuern. Durch entsprechend angepasste Induktorkonzentrationen konnten BRP-Expressionsstärken realisiert werden, welche eine kontinuierliche und effiziente Proteinsekretion in das Kulturmedium eriaubten ohne das bakterielle Wachstum zum Erliegen zu bringen. Dabei wurden extrazelluläre Anteile der verwendeten Modellproteine von 90-95% erzielt. Eine effiziente Sekretion war jedoch stets mit einer Reduktion des Wachstums verbunden, so dass die optimale Produktionsstrategie einen Kompromiss aus Sekretionseffizienz und Wachstumsgeschwindigkeit darstellte. Alternativ konnte durch Induktion mit hohen Arabinosekonzentrationen eine starke BRP-Expression erreicht werden. Dies erlaubte eine schnelle Sekretion der gebildeten Proteine bei maximalen Biomassekonzentrationen nach unlimitiertem Wachstum. Mit einem extrazellulären Anteil von 89% wurden dabei vergleichbare Sekretionseffizienzen erzielt, wie bei angepasster, wachstumspermissiver BRP-Expression. Die strikte Freisetzung periplasmatischer Proteine bedeutete eine Trennung extrazellulärer Proteine, von cytoplasmatischen Proteinen, welche den Großteil der Wirtsproteine ausmachen. In Verbindung mit Analysen zur Proteinreinheit wurde dadurch das Potential der sekretorischen Proteinproduktion im Sinne einer Abreicherung zellulärer Verunreinigungen belegt. Zur Aufrechterhaltung der Induktion wurde ein E. coli MG 1655 Stamm konstruiert, der Arabinose nicht mehr verwerten kann. Als weiterer Bestandteil dieses Projektes wurde ein Expressionssystem etabliert, welches neben der sekretorischen Produktion auch eine direkte Affinitätsreinigung rekombinanter Proteine aus dem Medium ermöglichte. Dies konnte durch Anwendung des Maltosebindeproteins (MBP) realisiert werden. Varianten des MBP mit zwei unterschiedlichen Signalpeptiden erlaubten den Export heterologer Proteine in das Periplasma sowohl über den See- als auch den Tat-Pfad. Unter BRP-Coexpression konnte die Sekretion von MBP-Hybridproteinen bis zu 95% in das Medium gezeigt. Die Sekretionseffektivität war dabei von der Wahl des Translokationspfades in das Periplasma und von der Proteingröße abhängig, so dass die Freisetzung einiger Proteine mit geringerer Effizienz erfolgte. Der Sekretionsgrad betrug jedoch bei allen untersuchten Proteinen mindestens 50%. Die sekretierten Proteine konnten aufgrund der Affinitätsfunktion des MBP ehromatographisch in einem einzigen Schritt bis zu annähernder Homogenität gereinigt werden. Im Rahmen des Projekts wurden aus am Lehrstuhl für Fermentationstechnik der Universität Bielefeld durchgeführten Bioreaktorkultivierungen mit speziell konstruierten E.coli Stämmen im Institut für technische Chemie der Leibniz- Universität Hannover Genexpressionsanalysen durchgeführt. Mittels der generierten Daten aus den whole-genome Experimenten sowie Literaturangaben über Sekretions-involvierte Gene wurde ein sekretionsspezifischer low-density Microarray mit 109 Genen in 5 Replikaten entwickelt und zur routinemäßigen Applikation gebracht. Anhand von RNA-Proben welche schon auf Transkriptomebene mittels whole-genome Microarrays untersucht wurden, konnte die biologische Sinnhaltigkeit sowie die höhere Sensitivität gegenüber den whole-genome Experimenten gezeigt werden. Zusammenfassend lässt sich konstatieren, dass die zelluläre Antwort aufdie BRP-Expression in der Initiierung der SOS-Anttwort, der Antwort auf Membranstress sowie der vermehrten Expression von periplasmatischen Proteinen und Konstituenten der äußeren Membran besteht. Durch Coexpression dieser Komponenten sollte sich eine Erhöhung der Expressionsrate der BRPs, gleichbedeutend mit einer erhöhten Sekretion in den extrazellulären Raum, realisieren lassen. Zusätzlich wurde beobachtet, dass die Expression von pspA infolge übersättigter Exportkapazitäten signifikant erhöht wird. Durch Coexpressionstrategien mit pspA erfolgte der Nachweis, das man sich diesen Umstand zur Steigerung der sekretierten Proteinmenge zu Nutze machen kann. Zur leichteren Interpretation der Daten wurde ein spezielle Auswertesoftware mit direkter Kegg-Einbindung entwickelt und eine eigene Datenbank aufgebaut. Über GFP-Reporter und durchflusszytometrische Analysen konnte gezeigt werden, dass Gen- und Proteinexpression ähnlich verlaufen.
Publications
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(2006) Development of specific E.coli microarrays for the analysis of the protein secretion pathways sec and TAT. Dechema Statusseminar Chiptechnologien, Frankfurt, 2.-3.2. 2006
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(2006) Neue Auswerteverfahren zur robusten Quantifizierung von Mikroarray-Daten. Dechema Statusseminar Chiptechnologien, Frankfurt, 2.-3.2.
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Stahl, F.; Reck. M.; Repenning, C.; Hitzmann B.; Scheper. T.; Friehs, K.; Sommer, B.; Aster, A.; Flaschel, E.
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(2007) Neue ' Auswerteverfahren zur robusten Quanttfizierung von Mikroarray-Daten Dechema Statusseminar Chiptechnologien, Frankfurt, 1.-2.2.2007
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(2007) New analysis for a robust quantification of microarray data. European BioPerspectives 2007, May 30-01 June, 2007, Köln. Germany
Repenning, C.; Stahl, F.; Scheper, T.; Reck. M.; Hitzmann B.
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(2007) Transcriptional analysis of the protein secretion pathways sec and TAT in E.coli. Dechema Statusseminar Chiptechnologien, Frankfurt, 1.-2.2.2007
Reck. M.; Stahl, F.; Hitzmann B.; Scheper, T.; Friehs, K.; Sommer, B.; Aster, A.; Flaschel, E.
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(2007) Use of bacteriocin release proteins for the extracellular production of recombinant proteins with E. coli.. European BioPerspectives 2007, May 30-01 June, Köln, Germany
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(2008) Induzierte Sekretion und Affinitätsreinigung rekombinanter Proteine aus Fermentationsmedien von E. coli. Tagung „Von der Zelle zum Prozess" GVC/DECHEMA, 28.-30. April 2008, Bremen
Sommer, B.; Friehs, K.; Flaschel, E.
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(2008) Transcripttonal analysis of GFP encoding E. coli secretion strains using DNA-Microarray technology and flow cytometry. 4th International Conference on Analysis of Microbial Cells at the Single-Cell Level. May 22nd-25th 2008 in Bad Schandau
Moretti, P.; Reck, M.; Repenning, C.; Stahl, F.; Friehs, K.; Scheper, T.
