RNA-Funktionsmodule am Beispiel der Viroide: Pathogenität durch Produktion von siRNAs und Transkription durch Erkennung zellulärer Faktoren
Final Report Abstract
Zur Verteidigung gegen Pathogene besitzen Pflanzen einen Mechanismus zur sogenannten „RNA-Stilllegung" (RNA silencing), der mit Hilfe kleiner RNAs - silencing RNAs (siRNA) und genomisch kodierte microRNAs (miRNA) - abläuft. Viroide sind Pflanzen-infektiöse, nicht-kodierende, zirkuläre, einzelsträngige RNAs aus 240 bis 400 nt je nach Spezies. Viroide veurrsachen die Produktion von Viroid-spezifischen kleinen RNAs (vsRNA); diese scheinen jedoch nur einen geringen Einfluss auf die Vermehrung und systemische Verbreitung der Viroide zu besitzen, was möglicherweise auf der Kern-Lokalisation der Viroide bzw. dem Cytoplasma als Ort des Silencing-Prozesses beruht. Viroide mit kleinen Sequenzvariationen in der sogenannten pathogenitätsmödulierenden Sequenz- bzw. Struktur-Region (PM-Region) rufen verschiedene Symptome in infizierten Pflanzen hervor, was eine Beteiligung der vsRNAs an den Symptomen nahelegt. Um zu überprüfen, ob die nativ stäbchenförmige Sekundärstruktur der Viroide zu einer Fehlerkennung durch die pflanzlichen Dicer-ähnlichen Proteine als prä-miRNA führen kann, haben wir ein Programm names NOVOMIR entwickelt, das pflanzliche miRNA-Gene in einem Genom identifizieren kann. Dazu benutzt das Programm eine Reihe von Filterschritten und ein statistisches Modell, um prä-miRNAs von anderen RNAs zu unterscheiden; für die Vorhersage wird aber weder die Kenntnis der Ziel-RNA noch ein weiteres Genom benötigt. Obwohl pflanzliche prä-miRNAs heterogener als tierische prä-miRNAs bezüglich Länge und Struktur sind, detektiert NOVOMIR die pflanzlichen prä-miRNAs mit ~ 83% Sensitivität bzw. ~ 99% Spezifität im Genom von Arabidopsis thaliana. Lineare PSTVd-RNA, wie sie im Verlauf des Replikationszyklus von PSTVd auftritt, wird von NOVOMIR als mögliche prä-miRNA identifiziert; eine der zwei vorhergesagten miRNA-Positionen liegt in der PM-Region. Wir haben das Sequenzspektrum der vsRNAs nach einer Infektion von Tomatenpflanzen der Varietät Rutgers mit dem Kartoffel-Spindelknollen-Sucht-Viroid (potato spindle tuber viroid, PSTVd) AS 1 per „Deep-Sequencing" untersucht; die PSTVd-Variante ASI induziert drastische Symptome wie Zwergwuchs und Nekrosen in diesen Tomaten. Tatsächlich fanden wir vsRNAs aus der sogenannten pathogenitätsmodulierenden Region häufiger als aus anderen Regionen, was eine Beteiligung der vsRNAs an der Symptomausprägung unterstützt. Außerdem waren in den PSTVd-ASl-infizierten Pflanzen einige endogene miRNAs, die in die Blattentwicklung durch Regulation von Transkriptionsfaktoren eingreifen, in geringerer Menge als in den Kontroll-infizierten Pflanzen vorhanden. Dieser Befund unterstützt die Hypothese, dass eine nuRNA-anhängige Fehlregulation von Transkriptionsfaktoren Ursache für die Viroid-typischen Symptome ist.
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