Einzelmolekülspektroskopische Untersuchung der Transportvorgänge im Kernporenkomplex mit Hilfe biomimetrischer Modelle
Final Report Abstract
Dem Transport von Proteinen im Zytoplasma kommt eine wichtige Bedeutung bei der Regulation zellulärer Prozesse zu. Insbesondere der selektive, passive Transport von Proteinen durch den Kernporenkomplex ist noch nicht vollständig verstanden. Verschiedene Arbeiten deuten darauf hin, dass die Interaktion kurzer hydrophober Abschnitte, sogenannter FG-Repeats, dabei eine wichtige Rolle spielt. Um das Phänomen der passiven Diffusion durch die Kernpore modernen mikroskopischen Techniken zugänglich zu machen, haben wir begonnen, unterschiedliche Medien, wie das Zytoplasma oder das Kernporenlumen, durch unterschiedliche Proteingemische zu modellieren. Ausgehend von Proteinen, die auf Glasoberflächen immobilisiert werden sollten, sind wir schließlich bei hochkonzentrierten Proteingemischen angelangt, in denen wir die Diffusion verschiedener Fluoreszenz-markierter Proteine mit Hilfe der Fluoreszenzkorrelationsspektrosopie (FCS) untersuchen können. Ein wichtiger Teilaspekt des Projekts war die Entwicklung der bildgebenden Diffusionsmikroskopie, eines mikroskopischen Verfahrens mit dem die Heterogenität der Diffusion in strukturierten Medien visualisiert werden kann. Bei diesem Verfahren wird das Objekt mit einem konfokalen Mikroskop mit einer Messdauer von 25 - 100 ms/pixel abgetastet. Die innerhalb eines Bildpunktes detektierten Photonen werden nach der Messung autokorreliert und mit einem geeigneten Model angepasst, um die zeitliche Dynamik der Fluoreszenzemission, insbesondere den Einfluss durch Diffusion, quantitativ zu erfassen. Die Schwierigkeit lag hierbei in der Etablierung eines automatisierten Verfahrens zur unüberwachten Analyse der Autokorrelationsdaten, die gleichzeitig mit einem hohen Datenaufkommen verbunden ist. Trotz der relativen hohen Messdauer konnten wir die prinzipielle Tauglichkeit der bildgebenden Diffusionsmikroskopie demonstrieren. Darüber hinaus konnten wir die Methode erfolgreich in lebenden Zellen zur Anwendung bringen und damit Heterogenitäten in der Diffusion von markierten DNA-Sonden im Zellkern von Fibroblasten visualisieren. Inzwischen wenden wir die Methode zur Untersuchung der Diffusion verschiedener Proteine in lebenden Zellen an. Hierbei interessieren wir uns einerseits für die Diffusion von Signalproteinen des JAK/STAT-Signalwegs und andererseits für die Chemotaxis von E.coli, insbesondere die Signaltransduktion zwischen den Rezeptorclustern und den Flagellenmotoren. Bei der Simulation des Zytoplasmas standen wir zunächst vor dem Problem, dass der Beitrag der Autofluoreszenz von Proteinen, wie BSA, schon ab einer Konzentration von ca. 180 mg/ml Protein die Messung der Diffusionszeit mit FCS verhindert. Wir konnten dieses Problem lösen und selbst bei physiologischen Bedingungen (-400 mg/ml Protein) messen, indem wir Gemische verschiedener Proteine einsetzen. Hierbei haben wir die interessante Beobachtung gemacht, dass die Erhöhung der Proteinkonzentration auf kleine Moleküle und Proteine, wie den Fluoreszenzfarbstoff ATTO 633 oder Ovalbumin, deren Diffusion stärker beeinflusst als das bei größeren Proteinen, wie BSA oder Importin-ß der Fall ist. Wie erwartet haben wir in künstlichem Zytoplasma keinen Unterschied in der Diffusion von BSA und Importin-ß gefunden.
Publications
- (2006), Single molecule fluorescence spectroscopy - Approaches towards quantitative investigations of structure and dynamics in living cells. SPIE Proc. 6092
D. Siegberg, C.M. Roth, D.P. Herten
- (2007). Imaging Diffusion in Living Cells Using Time-Correlated Single-Photon Counting. Anal Chem 79, 7340 - 7345
C.M. Roth, P.I. Heinlein, M. Heilemann, D.P. Herten
