Funktionelle Charakterisierung von Adenylat Zyklasen der Honigbiene
Final Report Abstract
Das Ziel des Projekts war die molekulare Identifizierung und Charakterisierung membranständiger Adenylat Zyklasen der Honigbiene. Viele Verhaltensreaktionen der Honigbiene, insbesondere Lernen und Gedächtnis, werden mit Änderungen der zellulären cAMP-Konzentrationen in Verbindung gebracht. Der intrazelluläre Botenstoff cAMP wird von Adenylat Zyklasen synthetisiert. Über die molekulare Struktur und das zelluläre Verteilungsmuster von Adenylat Zyklasen der Honigbiene war zu Beginn unseres Projekts nichts bekannt. Es ist uns gelungen, zwei cDNAs zu klonieren, die für vollständige Adenylat Zyklasen kodieren (AmAC3 und AmAC8). Beide Proteine verfügen über die charakteristischen Merkmale membranständiger Adenylat Zyklasen. Die Amac3 cDNA haben wir stabil in HEK-293 Zellen transfiziert. Dies ermöglichte uns die umfassende Untersuchung der biochemischen und pharmakologischen Eigenschaften des Enzyms. Die AmAC3 wird durch Forskolin aktiviert (EC50 in intakten Zellen 15,2 µM). P-Seitenanaloga inhibieren das Enzym, wobei 2’,5’Dideoxy3’ATP mit einem IC50 Wert von 180 nM der effizienteste Antagonist ist. Immunhistologische Färbungen mit spezifischen anti-AmAC3 Antikörpern erlaubte uns das Verteilungsmuster des Proteins im Bienengehirn aufzuklären. Die pharmakologischen Eigenschaften der Adenylat Zyklasen, die in Antennalloben exprimiert werden, stimmen sehr gut mit den Eigenschaften der heterolog exprimierten AmAC3 überein. Deshalb nehmen wir an, dass die AmAC3 den größten Anteil aller nativen Adenylat Zyklasen ausmacht, die in den Antennalloben adulter Honigbienen vorhanden sind. Immunhistologische Färbungen mit spezifischen anti-AmAC8 Antikörpern haben ein nahezu komplementäres Verteilungsmuster zu dem der AmAC3 ergeben. In einem weiteren Versuchsabschnitt haben wir versucht, die Amac3 Expression im Bienengehirn durch Injektion spezifischer dsAmac3 RNA herabzuregulieren und die Auswirkung auf das Verhalten der Tiere zu dokumentieren. Obwohl die Verhaltensexperimente (GRS) eine Erhöhung der Saccharoseempfindlichkeit bei Verwendung der dsAmac8 RNA im Vergleich zu Kontrolltieren anzeigte, konnte eine Abnahme der Amac3 RNA mit molekularbiologischen Methoden (quantitative PCR) nicht eindeutig nachgewiesen werden. Abschließende Experimente mit Fluoreszenzfarbstoff markierten dsRNA Molekülen zeigten, dass diese nicht von den Neuronen aufgenommen wurden. Wir schließen aus diesen Ergebnissen, dass eine andere Strategie entwickelt und erprobt werden muss, um den spezifischen Gen knock down in Neuronen adulter Honigbienen zu realisieren. Wir hoffen, dieses Problem im Rahmen der noch ausstehenden Doktorarbeit angehen zu können und so die funktionelle Bedeutung der verschiedenen Adenylat Zyklasen für unterschiedliche Formen der Verhaltensplastizität der Honigbiene aufzuklären.
Publications
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