Funktionelle Untersuchungen zur zellulären Funktion, Regulation und Pathophysiologie des Kupfertransportproteins ATP7B
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Spurenelement Kupfer ist essenziell in zellulären Systemen. Die Kupferbalance wird in engen Grenzen reguliert. Die hepatische Kupferakkumulation aufgrund einer genetischen Störung (ATP7B-Gendefekt) führt zu Morbus Wilson mit weit reichenden pathologischen Folgen für den Organismus. Diese sind erkennbar an der zunehmenden Leberschädigung und/oder schweren neurologischen Störungen. Die Wirkmechanismen der ATP7B-Mutationen als Ursache für den Morbus Wilson, die molekularen und zellulären Auswirkungen der Kupferakkumulation in der Leber sowie Resistenzmechanismen gegen Kupfertoxizität sind noch weitgehend ungeklärt. Im Projekt wurden die Auswirkungen patiententypischer Mutationen nach Proteinexpression in verschiedenen Expressionssystemen untersucht. Mutationen wiesen häufig negative Effekte auf die katalytische Phosphorylierung, einer Schlüsseleigenschaft von ATP7B auf. Als neuer Wirkmechanismus wurde die Hyperphosphorylierung nachgewiesen. Diese Störungen des Enzymmechanismus führen bei den meisten Mutationen zu Störung des Kupfertransports, einer weiteren Schlüsseleigenschaft des Proteins. Überdies konnte bei weiteren patiententypischen Mutationen eine Störung der Proteinlokalisation und kupferinduzierten Translokation (sog. trafficking) von ATP7B nachgewiesen werden. ATP7B wird bei bestimmten malignen Tumoren überexprimiert und führt häufig zu einer Resistenz gegen das Zytostatikum Cisplatin. Im Projekt konnte gezeigt werden, dass Cisplatin mit ATP7B interagiert und zur katalytischen Phosphorylierung führt, aber nicht aktiv transportiert wird und auch kein trafficking auslöst. Die gegenseitigen Wechselwirkungen wirken sich auf die Kupferhomöostase der Tumorzelle aus und beeinflussen auf diese Weise die Cisplatinresistenz von Hepatomzellen, wie in den Untersuchungen nachgewiesen werden konnte. Kupferakkumulation führt zu chronischer Entzündung und neoplastischer Proliferation in der Leber der Atp7b-/-Maus, einem Tiermodell für den Morbus Wilson. Durch Genexpressionsanalysen konnte gezeigt werden, dass die Kupferakkumulation zu Überexpression von Proliferationsgenen und spezifischer Signalwege, u.a. des kanonischen WNT-pathways und Herab-regulation von Tumorsuppressor-Signalwegen, wie PTEN- oder p53-Signalweg führt. Ein weiteres Teilprojekt widmete sich der Auswirkung der Kupfertoxizität auf Lebermitochondrien. Kupfer führt zu frei-radikalischer Fragmentierung des mitochondrialen Lipids Cardiolipin und führt damit zur strukturellen und funktionellen Schädigung von Mitochondrien wie durch in vitro Untersuchungen und bei murinen Mitochondrien in vivo gezeigt werden konnte. Aktuelle Forschungen haben Einflüsse des Kupferhaushaltes auf die multifaktorielle Genese der Atherosklerose gefunden, eigene Untersuchungen haben darüber hinaus Zusammenhänge zwischen Kupferspeicherung und dem Cholesterolstoffwechsel aufgedeckt, beides ist jedoch noch unzureichend verstanden. Die Auswirkungen einer Interaktion von Kupfer- und Lipidstoffwechselstörung auf die Atherogenese wurden erstmals experimentell belegt. Durch Kreuzungen der Atp7b-/-Maus auf den LDL-Rezeptor-/-Hintergrund konnte gezeigt werden, dass Kupferakkumulation in der Leber zur Herabregulation von Genen der Cholesterolbiosynthese und niedriger Serumlipide führt und Einflüsse auf die Ausprägung der Atherosklerose in den Atp7b-/-/LDL-Rezeptor-/-Mäusen hat. Durch Kreuzungsversuche von Atp7b-/-- mit Metallothionein-/-Mäusen wurde ein wichtiger potentieller Resistenzmechanismus gegen Kupfertoxizität untersucht. Nachkommen dieser Doppelknockoutmäuse waren jedoch postnatal nicht lebensfähig, was die Bedeutung von Metallothionein als Resistenzmechanismus gegen hepatische Kupfertoxizität unterstreicht. Die gewonnenen Erkenntnisse der molekularen Mechanismen des Kupferstoffwechsels bei Morbus Wilson, bei weiteren kupferbedingten Stoffwechselstörungen und Tumoren sind Grundlage für die Entwicklung innovativer Therapiestrategien und zur weiteren Erforschung der Pathogenese und Genotyp-Phänotyp Korrelation bei Morbus Wilson.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2006) Untersuchungen zur Funktion, Regulation und Pathophysiologie des Kupfertransportproteins ATP7B (Morbus Wilson Protein). Habilitation, Universität Leipzig
D Huster
- (2007) Etablierung eines Kupfertransportassays für das Morbus-Wilson- Protein ATP7B im Baculovirussystem und Nachweis des defekten Kupfertransports durch ATP7B-Mutanten. Dissertation, Universität Leipzig
V Toth (Jantsch)
- (2007) Wilson disease: not just a copper disorder. Analysis of a Wilson disease model demonstrates the link between copper and lipid metabolism. Mol Biosyst 3, 816-24
D Huster, S Lutsenko
- (2008) Formation of phosphatidic acid in stressed mitochondria. Arch Biochem Biophys 480, 17-26
IL Yurkova, F Stuckert, MA Kisel, OI Shadyro, J Arnhold, D Huster
- (2009) Dokl NAN Belarusi 53, 63
I Yurkova, OI Shadyro, MA Kisel, J Arnhold, D Huster
- (2009) Free radical fragmentation of cardiolipin by cytochrome C. Chem Phys Lipids 158, 16-21
IL Yurkova, D Huster, J Arnhold
- (2009) Functional Interactions of Cu-ATPase ATP7B with Cisplatin and the role of ATP7B in hepatoma cells resistance to the drug. J Biol Chem 284, 7793-7802
K Leonhardt, R Gebhardt, J Mössner, S Lutsenko, D Huster
- (2009) Hepatocyte GP73 expression in Wilson disease. J Hepatol 51, 557-564
L Wright, D Huster, S Lutsenko, F Wrba, P Ferenci, CJ Fimmel
- (2010) Wilson`s disease at a single cell level: intracellular copper redistribution activates compartment-specific responses in hepatocytes. J Biol Chem 285, 30875-30883
M Ralle, D Huster, S Vogt, JL Burkhead, B Lai, TR Capps, E Maryon, CL Corless, S Lutsenko
- (2011) Fragmentation of mitochondrial cardiolipin by copper ions in model membrane and the Atp7b-/-mouse. Chem Phys Lipids 164, 393-400
I Yurkova, J Arnhold, G Fitzl, D Huster
- (2012) Diverse functional properties of Wilson disease ATP7B variants. Gastroenterology 142, 947-56
D Huster, A Kühne, A Bhattacharjee, L Raines, V Jantsch, J Noe, W Schirrmeister, I Sommerer, O Sabri, F Berr, J Mössner, K Caca, S Lutsenko
(Siehe online unter https://doi.org/10.1053/j.gastro.2011.12.048) - (2012) Free-radical fragmentation in a polar part of lipids: a new pathway of the destruction and the formation of biologically active compounds. Habilitation, Weissrussische Staatsuniversität, Forschungsinstitut für Physiko-chemische Probleme, Minsk, Weissrussland
I Yurkova
- (2012) Funktionelle Untersuchungen der Auswirkung von Mutationen auf das humane Kupfertransportprotein ATP7B (Wilson ATPase). Dissertation, Universität Leipzig
A Kühne
