Selektion von Adeno-assoziierten viralen Vektoren zum effizienten und spezifischen Gentransfer in den Herzmuskel nach systemischer Verabreichung
Final Report Abstract
Adeno-assoziierte virale (AAV)-Vektoren sind von apathogenen Parvoviren abgeleitete Gentransfer-Vektoren, die bereits in klinischen Studien unter anderem auch zur Therapie der Herzinsuffizienz eingesetzt werden. Neben der Verwendung geeigneter Promotoren zum gezielten Gentransfer im Herzmuskel oder dem Einsatz spezifischer microRNAs zur Vermeidung von unerwünschter Expression beispielsweise in der Leber kommt der Modifikation der Vektoroberfläche eine zentrale Bedeutung zu, da sie die Passage des Vektors bzw. dessen Genoms von der Blutbahn bis zum Zellkern entscheidend determiniert. Zur Entwicklung von AAV-Vektoren, die sich zum effizienten und spezifischen Gentransfer in den Herzmuskel eignen, haben wir eine randomisierte Peptidbibliothek auf der AAV-Oberfläche exprimiert und zur Selektion gezielt Herzmuskel transduzierender Vektoren eingesetzt. Um Vektoren zu identifizieren, die einen transvaskulären Gentransfer ermöglichen, haben wir die AAV- Bibliotheken intravenös in adulte Mäuse injiziert. Die Herausforderung dieses Ansatzes bestand darin, die in den einzelnen Selektionsrunden in die Herzmuskelzellen aufgenommen Bibliotheksvektoren effizient anzureichern und zu identifzieren. Hierzu haben wir nach Injektion der AAV-Bibliotheken die Herzen entnommen und in 300µm dicken Schnitten in vitro propagiert. Die Überinfektion dieser Schnitte mit Adenoviren führte zur Amplifikation der erfolgreich aufgenommenen AAV-Bibliotheksvektoren, die daraufhin mittels PCR-Techniken weiter angereichert wurden und schließlich zur Sequenzierung und parallelen Herstellung einer weiteren Bibliothek für die nächste Selektionsrunde verwendet werden konnten. Nach drei Runden konnten AAV-Vektoren angereichert, von denen einer effizienter und spezifischer als der Ausgangsvektor Herzmuskelgewebe transduzieren konnte. Die Eignung dieses Vektorsystems zum therapeutischen Gentransfer konnte durch Transfer der intakten ?-Sarkoglykan-cDNA in Mäuse nachgewiesen werden, die aufgrund des Fehlens dieses Gens den Phänotyp einer hereditären Herzmuskelerkrankung (Dilatative Kardiomyopathie) aufweisen. Die systemische Gabe eines AAV-Vektors (AAV2-VNSTRLP) in Mäusen führte zu einer hocheffizienten Genexpression der ?-Sarkoglykan-cDNA im Herzmuskel ähnlich wie mit dem für eine Herzmuskeltransduktion besonders geeigneten AAV-Serotyp 9. Im Gegensatz zu AAV9-Vektoren wies AAV2-VNSTRLP bei fehlender Skelettmuskelexpression eine höhere Spezifität auf. Die Wiederherstellung von ?-Sarkoglykan im Herzmuskel adulter ?- Sarkoglykan-defizienter Mäuse konnte in einer Langzeitstudie die Ausbildung einer Herzinsuffizienz verhindern. Weitere Selektionsrunden auf humanen Herzmuskelzellen bzw. Herzmuskel in Großtiermodellen könnte in Kombination mit geeigneten Applikationsverfahren wie Retroinfusion in Koronarvenen oder Ultraschall-gestützter Destruktion AAV-beladener Mikrosphären zur Entwicklung klinisch einsetzbarer Vektoren führen.
Publications
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