Fluoreszenzlebensdauer-Manipulation in den autofluoreszierenden Proteinen: Entwicklungsstrategie für neue Anwendungen
Final Report Abstract
In dem vorliegenden Projekt wurde untersucht, in wieweit sich die Fluoreszenzlebensdauer (τFl) in den Fluoreszenzproteinen für analytische Anwendungen heranziehen lässt. Quantifizierungen über τFl bieten den Vorteil, dass τFl unabhängig von der Indikatorkonzentration ist und deswegen diese Art der Analytik ideal für die unterschiedlichen Expressionslevels der Fluoreszenzproteine geeignet ist. Zu Beginn wurde die Photokonversion, d.h. die lichtgetriebene Decarboxylierung einer chromophornahen Aminosäure, als mutmaßlich intrinsisches Problem der Fluoreszenzlebensdauermikroskopie (FLIM) identifiziert. In der Folgezeit konnten zwei Verfahren – zum einen unter Ausnutzung des Protonentransfers im angeregten Zustand und zum anderen durch eine Punktmutation – entwickelt werden, mit denen sich mögliche Verzerrungen von FLIM-Messungen verhindern lassen. Experimente, die kurz vor Beendigung des Projektes durchgeführt wurden, lassen allerdings daran zweifeln, dass die Photokonversion immer zu einer Reduktion von τFl führt. Parallel dazu wurden mehrere Ansätze verfolgt, um geeignete FLIM-Indikatoren auf der Basis der Fluoreszenzproteine zu entwickeln. Während es trotz anfänglicher, kleiner Effekte weder bei den Redoxindikatoren noch bei den Blau Fluoreszierenden Proteinen gelang, diese zu optimieren, konnte ein bioanalytischer Ansatz entwickelt werden, mit dem die in-vivo Aufnahme von Kupferionen durch FLIM visualisiert werden kann. Die Veränderung von τFl beruht auf der blauen Farbe des komplexierten Cu2+, welches als Energietransfer-Akzeptor wirken kann. Sowohl die Bindungsstelle wie auch ihre Cu2+-Affinität konnte vollständig charakterisiert werden, so dass intrazelluläre Quantifizierungen dieses wichtigen Spurenelementes möglich sind. Im Rückblick auf den Projektverlauf läßt sich festhalten, dass die Lebensdauermanipulation durch Punktmutationen qualitativ voraussagbar ist, für die Entwicklung von anwendbaren Fluoreszenzproteinen, die sowohl in ihren Faltungseigenschaften wie auch in dem Ausmaß der Änderung von τFl optimiert sind, bedarf es einer technischen und personellen Ausstattung, die eher in rein molekularbiologischen/biochemischen Laboren zu finden ist. Diese Gruppen gilt es für diese Art der bioanalytischen Fragestellungen zu sensibilisieren.
Publications
- Problems encountered in FLIM due to Photoconversion of Autofluorescent Proteins. In: Proceedings of the IX. Linz Winter Workshop 2007, Advances in Single Molecule Research for Biology and Nanoscience (Peter Hinterdorfer, Gerhard Schütz, Peter Pohl, Eds.), Schriftenreihe Biophysik 2, Tauner, Linz (AT), 2008, p. 74-79
G. Jung, M. Werner, M. Schneider
- Efficient Photoconversion distorts Fluorescence Lifetime in Confocal Microscopy. ChemPhysChem 9 (2008), 1867-1874
G. Jung, M. Werner, M. Schneider
- Ultrafast photoconversion of the green fluorescent protein studied by accumulative femtosecond spectroscopy. Biophys. J. 26 (2009), 2763-2770
F. Langhojer, F. Dimler, G. Jung, T. Brixner
