Design, Synthese und NMR-Bindungsstudien von VEGF bindenden Peptiden
Final Report Abstract
Ziel dieses Projektes war es, Liganden zu finden, welche an das Protein VEGF binden. VEGF (vascular endothelial growth factor) ist ein sogenannter proangiogenetischen Botenstoffen, seine Rolle besteht somit darin Angiogenese, die Ausbildung neuer Blutgefäße zu schon bestehenden Gefäßen, zu stimulieren. Da die Angiogenese auch wesentlicher Prozeß für Wachstum und Metastasierung von Krebszellen ist, ergibt sich hierdurch ein Ansatzpunkt für die Tumortherapie. Das Ziel ist hierbei, zu versuchen diesen Prozeß zu unterbinden, um somit die Krebszellen quasi „auszuhungern“. Praktisch sieht es dann so aus, daß man die Wechselwirkung von VEGF mit seinem Rezeptor zu unterbinden versucht, indem man entweder den Rezeptor, oder alternativ den Botenstoff VEGF blockiert. Letzteres sollte dann auch die Aufgabe dieses Projektes darstellen. Die durchgeführte Arbeit läßt sich in drei Teilbereiche unterteilen, die Gewinnung des Proteins, Synthese der potentiellen Kandidaten und schließlich Evaluierung der Verbindungen mittels NMR-Spektroskopie. Das Protein wurde nach bekanntem Protokoll exprimiert und aufgereinigt. Für die NMR-Spektroskopie wurde es dann noch mit 13CH3-Met und/oder 15N-markiert, was das Testen der Liganden, durch die hierbei vergleichsweise kurzen Meßzeiten, enorm beschleunigte. Zur Synthese, da es in der Arbeitsgruppe Giralt gelang, über das Screening von Extrakten aus Pflanzen der traditionellen chinesischen Medizin, eine Substanz zu isolieren und zu charakterisieren (das Flavonoid Baikalin), welche selektiv an die Oberfläche von VEGF zu binden in der Lage war, ergab sich die Idee, dieses Naturprodukt synthetisch zu modifizieren, um somit wenn möglich die Bindung zu optimieren. Es wurden dann entsprechende Molekülbibliotheken dargestellt, und NMR-spektroskopisch untersucht. Hierbei wurde zunächst generell auf Bindung getestete. Für positive Kandidaten wurde dann noch die Art der Bindung ermittelt (selektiv oder nicht, wo findet sie statt, welche Gruppen sind hierbei involviert etc.). Diese Ergebnisse flossen dann wiederum in die Synthese mit ein. Schlußendlich gelang es somit, Baikalin so zu modifizieren, daß die ursprüngliche Bindungskonstante um eine Größenordnung (0.5mM statt 5mM) verbessert werden konnte. Da die Möglichkeit der Modifizierung von Baikalin limitiert ist, oder nur mit sehr großem synthetischen Aufwand zu erreichen ist, war die nächste Idee, neue Moleküle zu synthetisieren, welche gewisse Strukturmerkmale von Baikalin aufweisen sollten, aber einfacher zu modifizieren sind, somit generell mit weniger komplexen Molekülen als Basis zu starten. Auf diesen Überlegungen beruhend wurden dann mit Aminosäuren modifizierte Coumarinderivate synthetisiert und getestet. Auch hier konnten Moleküle gefunden werden welche VEGF zu komplexieren in der Lage waren. Die besten Kandidaten waren dann von der Bindung auch im Bereich der besten Baikalinderivate. Wiederum wurden die Bindungsverhältnisse untersucht, wobei sich zeigte, daß auch hier die Komplexierung in der Region erfolgte, welche bei der Bindung von VEGF zu seinen Rezeptoren beteiligt ist. Weiter zeigte sich noch, daß die Coumarinderivate durch ihre Wechselwirkung mit VEGF, dessen konformationelle Dynamik „ausbremsen“. Somit wurden mit Baikalin, seinen Derivaten und den Coumarinverbindungen, meines Wissens, die ersten kleinen Moleküle erhalten (bisher waren nur Phagen-Peptide und Antikörper bekannt), welche in der Lage sind an VEGF zu binden. Wobei einzuschränkend hinzuzufügen ist, daß die hier erzielten Bindungskonstanten ganz klar noch zu schwach sind. Ein Projekt welches zuletzt noch in Angriff genommen wurde, hatte zur Aufgabe, durch Einbau von Azobenzen-Linker, welche photoinduziert von trans zu cis „geschaltet“ werden könne, die Konformation von VEGF, oder entsprechende Liganden, so zu ändern, daß entweder eine aktive oder eine inaktive Konformation vorliegen würde. Um den Linker in das Protein einzubauen, war es nötig eine Aminosäure (pro Monomer) durch Cystein zu ersetzen. Hier gelang zwar noch die Mutation, die Ausbildung des Dimers war aber nicht mehr möglich. Hauptsächlich über NMR konnte dann gezeigt werden, daß der Grund hierfür darin lag, daß sich jene Helix in welcher auch die Mutation erfolgte nicht mehr falten konnte, und da wiederum diese Helix essentiell für die Dimerisierung des Systems ist, eine solche damit nicht mehr möglich war.
