Optimierung von RNAi-Methode zur Durchführung funktioneller Genomik in Erdbeerfrüchten
Final Report Abstract
Das Einschleusen von doppelsträngiger Ribonukleinsäure (dsRNA), die korrespondierend zu spezifischen endogenen Gensequenzen ist, führt in vielen Organismen zur Inhibierung der entsprechenden Genfunktion. Dieser Effekt, auch RNA-Interferenz (RNAi) genannt, hat sich als wichtiges Werkzeug der Genomforschung bewährt. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Optimierung einer bereits etablierten RNAi-Methode zur Funktionsanalyse von Genen bei der Erdbeerfruchtreifung. Dazu wurden reifende Erdbeerfrüchte (Fragaria x ananassa cv. Elsanta) durch Infiltration von Agrobacterium tumefaciens Zellen mit selbstkomplementären intron-hairpin (ihp) Konstrukten der Zielgene FaCHS (F. x ananassa Chalconsynthase) und FaOMT (F. x ananassa O- Methyltransferase) transfiziert. Die transiente Genstilllegung konnte durch die Analyse der Transkriptmengen und korrespondierenden Metabolite bestätigt werden. Die Herabregulation der FaCHS Aktivität führte zu einem verminderten Pelargonidin-3-glucosid-Gehalt, daraus resultierte ein sichtbar hellerer Phänotyp der reifen Erdbeerfrüchte. Die Stilllegung der Genfunktion der FaOMT führte zu einem verringerten Gehalt an 2,5-Dimethyl-4-methoxy- 3[2H]-furanon (DMMF). Die Effekte waren mit denen in stabil transgen herabregulierten Erdbeerpflanzen vergleichbar. Die Ausprägung der Herabregulation war von dem verwendeten Sequenzabschnitt des Zielgens unabhängig da alle eingesetzten Nukleotidsequenzen über die gesamten Volllängen beider Zielgene, mit Längen von 219 bis 303 Basenpaaren, zu einer signifikanten Herabregulation der jeweiligen Genexpression führten. Aufgrund der Untersuchungen zum Einfluss der Zielstruktur kann auf einen transitiven Effekt der Signalfortpflanzung bei der Genstilllegung mittels Expression von ihpRNAs geschlossen werden. Diese Vermutung wird durch die Tatsache gestützt, dass für beide Gene unabhängig von der eingesetzten Nukleotidsequenz eine gleichmäßige Herabregulierung erreicht wurde, siRNAs (short-interfering RNAs) außerhalb des Sequenzbereichs der ihp- Konstrukte nachgewiesen werden konnten und mit Hilfe eines Genstilllegung-induzierenden Konstruktes zusammen mit einer chimären primären Zielsequenz ein sekundäres Ziel (FaCHS) herabreguliert werden konnte. Die signifikant verringerte Enzymaktivität der FaCHS durch eine Stilllegung der Genfunktion und die entsprechend signifikante Verschiebung der betroffenen Metabolite lässt außerdem die Herabregulation von homologen Allelen des Zielgens im Blütenboden vermuten. Ein für die Stilllegung der FaCHS unerwarteter off target Effekt war die signifikant erhöhte Festigkeit der Erdbeerfrüchte mit herabregulierter Genfunktion. Durch die verminderte FaCHS Aktivität akkumulierten die Vorläufermoleküle der Flavonoidbiosynthese. In Folge wurden diese Phenylpropanoide anstatt in den Flavonoid- in den Ligninstoffwechsel umgeleitet. Daraus resultierte eine vermehrte Bildung von Lignin in den Früchten mit herabregulierter FaCHS, das zu der erhöhten Festigkeit führte. Alternativ sollte zur Herabregulation von Zielgenen durch virus induced gene silencing (VIGS) in Fragaria der rekombinante Strawberry mild yellow edge virus (SMYEV) verwendet werden. Es wurden jedoch nach Verwendung der hergestellten Konstrukte keine phänotypische Veränderungen an den Agroinfiltrierten Früchten beobachtet. RT-PCR-Analysen von Gesamt-RNA von stabil transgenen Erdbeerpflanzen, die mit den VIGS- Konstrukten transformiert worden waren zeigten, dass im Vergleich zu den Ergebnissen mit genomischer DNA das Zielgen-Fragment teilweise oder komplett durch Rekombination aus dem SMYEV-Genom eliminiert worden war. Die in der vorliegenden Arbeit vorgestellte Methode der transienten RNAi zur Genstilllegung in Erdbeerfrüchten ist ein für die funktionelle Analyse reifekorrelierter Gene in planta sehr gut geeignetes System. Verglichen mit der Methode der stabil transgenen Genabschaltung erfordert dieses hier entwickelte transiente System wesentlich weniger Zeit. Dieser Vorteil und die leichte Übertragbarkeit durch die Agrobakterieninfiltration macht es auch für die Anwendung in anderen Früchten interessant.
Publications
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RNAi-induced silencing of gene expression in strawberry fruit (Fragaria x ananassa) by agroinfiltration: a rapid assay for gene function analysis. Plant J. 2006 48(5):818-82
Hoffmann T, Kalinowski G, Schwab W
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Redirection of flavonoid biosynthesis through the downregulation of an anthocyanidin glucosyltransferase in ripening strawberry (Fragaria x ananassa) fruit. Plant Physiol. 2008 146:1528-1539
Griesser M, Hoffmann T, Bellido, ML, Rosati C, Fink B, Kurtzer R, Aharoni A, Munoz-Blanco J, Schwab W
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Etablierung einer RNAi-Methode zur funktionellen Genomik in Erdbeeren. Dissertation, TU Muenchen, 2009
Kalinowski, G
