Biosynthese von Nitroverbindungen: Struktur und Funktion einer Mangan-abhängigen N-Oxygenase
Final Report Abstract
Nitrogruppen sind relativ seltene Strukturelemente von Naturstoffen, die allerdings in unterschiedlichsten Verbindungsklassen vorkommen und signifikant zur biologischen Aktivität beitragen (Bsp. Chloramphenicol, Aureothin). Bis heute kennt man nur zwei Enzyme, die die Reaktion von einem Arylamin zu einer Arylnitroverbindung katalysieren, die Rieske-Zentrum enthaltende Aminopyrrolnitrin-N-Oxygenase (PrnD) und die manganabhängige Arylamin-N-Oxygenase (AurF). In diesem Projekt wurde strukturbiologische, biochemische und chemische/analytische Methoden eingesetzt, um die Funktionsweise von AurF zu studieren und den Einsatz als Biokatalysator zu evaluieren. Hochreines AurF konnte kristallisiert und die Röntgenkristallstruktur mit einer Auflösung von 2,1Å aufgeklärt werden. Damit wurde erstmalig die Struktur einer N-Oxygenase gelöst. Das Protein liegt als Homodimer vor, und die Messung der anormalen Diffraktion für Eisen- und Manganatome ergab zweifelsfrei einen binuklearen Mangan-Cluster in jeder AurF- Untereinheit. Damit wurde auch erstmalig die Struktur einer binuklearen Mn-abhängigen Monooxygenase beschrieben. Mutageneseexperimente bestätigten sowohl die Metallkoordinationssphäre als auch eine Induced-Fit-Substratbindung. Darüber hinaus wurde durch die Mutation einzelner Aminosäuren die Enzymaktivität um ein Mehrfaches erhöht. Aus der Gesamtheit der Ergebnisse konnte in Analogie zu binuklearen Eisen- Monooxygenasen ein radikalischer Mechanismus formuliert und ein räumliches Funktionsmodell erstellt werden. In die Substratbindetasche wurden Mutationen eingeführt und die Mutanten auf verschiedene Substrate in in vitro- und in vivo-Enzymassays getestet. Aus den Ergebnissen wurde ein erweitertes Substratbindemodell aufgestellt. Demnach wird das Substrat über Wasserstoffbrücken fixiert. Außerdem wurde hieraus ein hypothetischer radikalischer Mechanismus mit Übergangszustand abgeleitet. In in vitro-Enzymassays mit PABA konnte das bisher noch nicht nachgewiesene Nitroso-Intermediat aufgefunden werden, das im Modell der sequentiellen N-Monooxygenierung postuliert wurde. Aus Aktivitätsstudien mit AurF-Varianten, die in Kulturen unter unterschiedlichem Mangan-Eisen- Verhältnissen produziert worden waren, konnte die Abhängigkeit der Aktivität von Mangan weiter bekräftigt werden. Über bioinformatischen Methoden ein Wasserstoffbrückennetzwerk vorgeschlagen werden, über das Elektronen in das Innere geschleust werden können. Darüber hinaus konnte über Mutagenese und Modeling abgeleitet werden, an welcher Stelle Ferredoxin andockt. Insgesamt wurde mit AurF der erste Vertreter einer neuen Enzymsubklasse charakterisiert, es wurden grundsätzliche Erkenntnisse zur Biosynthese von Nitrogruppen gewonnen und innovative Möglichkeiten für die Biokatalyse eröffnet.
Publications
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A Binuclear Manganese Cluster Catalyzing Radical-Mediated N-Oxygenation. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 8605-8608
R. Winkler, G. Zocher, I. Richter, T. Friedrich, G. E. Schulz & C. Hertweck
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Biosynthesis of Nitro Compounds. ChemBioChem 2007, 8, 973-977
R. Winkler & C. Hertweck
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Crystal Structure and Action of the N-Oxygenase AurF from Streptomyces thioluteus. J. Mol. Biol. 2007, 373, 65-74
G. Zocher, R. Winkler, C. Hertweck & G. Schulz
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Structural and Biochemical Basis for the Firm Chemo- and Regioselectivity of the Nitro-forming N-Oxygenase AurF. Chem. Commun. 2010, 46, 7760-7762
A. Fries, R. Winkler & C. Hertweck
