Die Bedeutung der subzellulären Kompartimentierung der Glutathion-Biosynthese für die zelluläre Redoxhomöostase in Arabidopsis
Final Report Abstract
Die Homöostase von Glutathion (GSH) in Pflanzen ist essentiell für die zelluläre Redoxkontrolle und eine effiziente Reaktion auf abiotische und biotische Stressfaktoren. Die subzelluläre Kompartimentierung der GSH-Biosynthese zwischen Plastiden und Cytosol ist ein spezifisches Merkmal von Pflanzen. Dabei liegt das Enzym y-Glutamylcystein Ligase (GSH1), das den ersten Syntheseschritt zum y-Glutamylcystein (y-EC) katalysiert, ausschließlich in den Plastiden vor, während das zweite Enzym, die Glutathlonsynthase (GSH2), sowohl in den Plastiden als auch im Cytosol vorliegt. Diese Verteilung der Biosyntheseenzyme erfordert den Export von y-EC aus den Plastiden, um im Cytosol GSH synthetisieren zu können. Durch kompartimentspezifische Expression einer Wildtyp GSH2 Sequenz entweder im Cytosol oder in den Plastiden konnte die gsh2 Mutante jeweils voll komplementiert werden. In diesen Komplementationslinien wurden weder hinsichtlich der Entwicklung noch hinsichtlich der Stressresistenz auffällige Unterschiede zum Wildtyp beobachtet. Diese Beobachtungen unterstützen die Schlussfolgerung, dass eine kompartimentspezifische GSH-Synthese für das Pflanzenwachstum ausreichend ist. Gleichzeitig konnte durch Cytosol-spezifische Komplementation der gsh2 Mutante zweifelsfrei gezeigt werden, dass y-EC aus den Plastiden exportiert wird und GSH in ausreichendem Maße zurück in die Plastiden transportiert werden kann, um dort die gesamte GSH-Biosynthese über eine Feedback-Regulation der GSH1 effektiv zu kontrollieren. Der Export von y-EC aus den Plastiden wird durch eine neue Klasse von Transportproteinen auf der inneren Piastidenmembran vermittelt. Fehlen diese Proteine, kann die gsh2 Mutante kein y-EC mehr aus den Plastiden exportieren und es entsteht ein charakteristischer letaler Phänotyp während des frühen Herzstadiums der Embryogenese. Im Rahmen dieses Projekts konnte gezeigt werden, dass redox-sensitives GFP (roGFP) spezifisch mit Glutaredoxinen interagiert und somit das Redoxpotential des Glutathionpuffers anzeigt. Die Equilibrierung von roGFP mit dem lokalen Glutathion-Redoxpotential konnte auch nach Expression des Biosensors in Arabidopsis gezeigt werden. Die erhaltenen Ergebnisse belegen, dass der Glutathionpuffer im Cytosol von Arabidopsis sehr viel stärker reduziert ist als vorher angenommen. Die Expression von roGFP in verschieden subzellulären Kompartimenten bietet eine neue Möglichkeit zur kompartimentspezifischen Analyse des Glutathionmetabolismus. Hier konnte durch roGFP Expression im Cytosol und den Plastiden neu isolierter y-EC-Transportmutanten gezeigt werden, dass nach Ausfall des plastidären y-EC-Transporters der GSH-Gehalt im Cytosol erniedrigt ist. Weiterhin bietet roGFP in Zukunft eine neue Möglichkeit zur nicht-invasiven dynamischen Messung GSH-abhängiger Redoxsignale.
Publications
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Redox-sensitive GFP is directly responsive to the cellular glutathione redox buffer and enables dynamic redox measurements in intact plants, Tri-National Arabidopsis Meeting, Tübingen, September 2006
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