Ammonium-nutzende MST Enzyme: Aufklärung der mechanistischen Grundlagen der Reaktionsspezifitäten, der Feedback-Inhibition und der allosterischen Interaktionen

• Antragsteller: Professor Dr. Reinhard Sterner
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Bioinformatik und Theoretische Biologie ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung seit 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 548227467

Die beiden evolutionär verwandten Enzymkomplexe Anthranilat-Synthase (AS) und Aminodeoxychorismat-Synthase (ADCS) bestehen aus strukturell und funktionell ähnlichen Glutaminase- und Synthase-Untereinheiten (UE), deren katalytische Aktivitäten eng aufeinander abgestimmt sind. Im aktiven Zentrum der Synthase-UE wird Chorismat durch nukleophile Addition des von der Glutaminase-UE erzeugten Ammoniak zu unterschiedlichen Vorläufermolekülen im Biosyntheseweg von Tryptophan (AS) bzw. Folat (ADCS) umgesetzt. Tryptophan wird von beiden Synthase-UEs gebunden, jedoch mit unterschiedlichen funktionellen Auswirkungen: Im Fall der AS als Feedback-Inhibitor, im Fall der ADCS als strukturstabilisierendes Element. Es ist sowohl aus enzymatischer als auch aus evolutionärer Sicht interessant, Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen AS und ADCS zu identifizieren, um (i) die katalytischen Mechanismen der Synthasereaktionen, (ii) die strukturelle Grundlage und die Evolution der Feedback-Inhibierung durch Tryptophan und (iii) die mechanistische Grundlage der Synthase-Glutaminase-Kommunikation zwischen den UEs aufzuklären. Die Enzyme paAS und paADCS aus dem pathogenen Organismus Pseudomonas aeruginosa sind besonders gut geeignet, um diese Fragestellungen zu beantworten, da sie aus verschiedenen Synthase-UEs (paTrpE bzw. paPabB), aber einer gemeinsamen amphibolischen Glutaminase-UE bestehen. Um die katalytischen Mechanismen von paTrpE und paPabB zu vergleichen, sollen die Affinitäten und Ratenkonstanten der Bindungsreaktion des Substrats Chorismat, des Kofaktors Mg2+ und des Reaktionsintermediates Aminodeoxyisochorismat mittels Gleichgewichts-titrationen und pre-steady-state kinetischen Messungen bestimmt werden. Darüber ist es geplant, die Reaktionsstöchiometrien der Glutaminase- und Synthasereaktionen sowie die Herkunft des in die Reaktionsprodukte eingebauten Ammoniaks mit Hilfe von gekoppelten Enzymassays und NMR-Spektroskopie zu untersuchen. Mit Hilfe von Kristallstrukturen von paAS und paADCS in Kombination mit MD-Simulationen und anzestraler Sequenzrekonstruktion sollen Aminosäurereste identifiziert werden, die für die unterschiedliche Funktion von Tryptophan in paTrpE und paPabB verantwortlich sind, um anschließend entsprechende Aminosäureaustausche zur Etablierung einer Inhibition durch Tryptophan in paPabB einzuführen. Schließlich sollen die molekularen Mechanismen der Kommunikation zwischen den Untereinheiten durch vergleichende strukturelle und funktionelle Analysen der Interaktionsflächen in paTrpE-paPabA und paPabB-paPabA aufgeklärt werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen