Analyse der pestiviralen Replikations- und Verpackungskomplexe mittels Proximity-Markierung und bioorthogonalem Crosslink

• Antragsteller: Professor Dr. Norbert Tautz
• Fachliche Zuordnung: Virologie
• Förderung: Förderung seit 2025
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 555234266

Der Aufbau der viralen Replikase und des pestiviralen Virions sind beides mehrstufige Prozesse. Die ihnen zugrundeliegenden Schritte sind weitgehend unbekannt, was vor allem auf technische Schwierigkeiten bei der Reinigung der beteiligten Multiproteinkomplexe und der Durchführung von Strukturstudien zurückzuführen ist. Beide Prozesse finden in enger Verbindung mit intrazellulären Membranen und einer noch unbekannten Anzahl von Wirtsfaktoren statt. Man geht davon aus, dass sich die pestiviralen Partikel in ER-Nähe assemblieren, höchstwahrscheinlich an der Oberfläche von Lipidtröpfchen, ähnlich wie es für HCV berichtet wurde. Dieses Projekt zielt darauf ab, die Zusammensetzung von Multiproteinkomplexen aufzuklären, die für die pestivirale RNA-Replikation und die Morphogenese des Virions wichtig sind. Entscheidend für diese Ziele ist die Fähigkeit, (i) virale oder zelluläre Proteine zu identifizieren die mit der pestiviralen Replikase und/oder mit dem Verpackungskomplex interagieren, und (ii) Aminosäuren zu identifizieren, die direkt an diesen Proteininteraktionen auf der Oberfläche dieser Komplexe beteiligt sind. Dieses Wissen kann zur Untersuchung des schrittweisen Zusammenbaus genutzt werden. Wie in diesem Antrag beschrieben, haben wir mit der Proximity-Markierung und der biorthogonalen Vernetzung zwei Methoden etabliert, um virale/zelluläre Replikase- und Verpackungskomponenten der Pestiviren zu identifizieren und ihre Rolle bei der Replikase-Assemblierung in lebenden Zellen zu entschlüsseln. Insbesondere die bioorthogonale Analyse der Replikase-Assemblierung soll eine detaillierte Landschaft von Protein-Protein-Interaktionen generieren, die für diesen Prozess erforderlich sind. Desweiteren sollen für die Assemblierung dieser Komplexe wichtige Proteinoberflächen identifiziert werden. Im Rahmen von Ziel 1 wird der Aufbau der pestiviralen Replikase genauer untersucht. Wir haben virale und zelluläre Proteine durch Proteinligase-vermittelte Biotinylierung identifiziert, die in enger räumlicher Nähe zu den viralen Replikasekomponenten NS4B- und NS5A lokalisiert sind. Wir werden die funktionelle(n) Rolle(n) der vielversprechendsten zellulären Replikase-Komponenten funktionell in entsprechenden Knockout-Zelllinien charakterisieren. Im Rahmen von Ziel 2 wird das pestivirale Core-Proxisom untersucht, um Einblicke in die Morphogenese pestiviraler Virionen zu gewinnen. Mit unserem neu etablierten NCP7 Npro-V5-TuID-Core Genom haben wir zelluläre Proteine identifiziert, die sich während der viralen Genomreplikation in unmittelbarer Nähe zu V5-TuID-Core befinden. Wir werden die vielversprechendsten zellulären Komponenten analysieren, indem wir entsprechende Knockout- oder Knockdown-Zelllinien erzeugen, um ihre Fähigkeit zur Unterstützung der RNA-Replikation und der Morphogenese von Virionen zu untersuchen. Damit sollen die Multiproteinkomplexe, die für die RNA-Replikation und Virionmorphogenese kritisch sind, im Detail charakterisiert werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen