Verständnis der Risiken bei der Genomeditierung: Analyse von Prime-Editing-Ergebnissen und großen genomischen Deletionen im Vergleich zu CRISPR/Cas9 in iPSCs

• Antragsteller: Andrea Rossi, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Humangenetik ; Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Entwicklungsbiologie
• Förderung: Förderung seit 2025
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 559465680

Genome-Engineering-Technologien, insbesondere CRISPR/Cas9, stellen Herausforderungen bei der Erzielung präziser und sicherer genetischer Modifikationen dar. Diese sind jedoch für die translationale Medizin von entscheidender Bedeutung. Konventionelles CRISPR/Cas9 induziert Doppelstrangbrüche (DSBs) in der DNA, die durch non-homologous end joining (nicht homologe Verbindung von DSBs, kurz: NHEJ) oder homology-directed repair(Reparatur von Doppelstrangbrüchen anhand homologer Sequenzen, kurz: HDR) repariert werden. Diese Reparaturmechanismen führen oft zu unbeabsichtigten On-Target-Effekten, einschließlich großer genomischer Deletionen, Insertionen (Indels) und struktureller Variationen, die die Genfunktion stören und zu genomischer Instabilität führen können. Während Off-Target-Effekte umfassend untersucht wurden, sind das Auftreten und das Ausmaß großer Deletionen an On-Target-Stellen weniger gut verstanden, was das Risiko birgt, hemizygote Mutationen fälschlicherweise als homozygot zu identifizieren, wenn große Deletionen unentdeckt bleiben. Prime Editing (PE) bietet einen präziseren und vielseitigeren Ansatz, indem es Basenaustausche, kleine Insertionen und Deletionen ohne die Erzeugung von DSBs ermöglicht, wodurch die Wahrscheinlichkeit unbeabsichtigter Modifikationen verringert wird. Trotz dieser Präzision besteht jedoch weiterhin die Notwendigkeit, die potenziellen On-Target-Risiken großer Deletionen und anderer unerwünschter Ereignisse im Zusammenhang mit PE systematisch zu bewerten. Ein direkter Vergleich von konventionellem CRISPR/Cas9 und PE in diesem Zusammenhang ist entscheidend, um die jeweiligen Risiken und Vorteile beider Technologien besser zu verstehen. In diesem Projekt untersuchen wir die On-Target-Effekte von CRISPR/Cas9 und PE in therapeutisch relevanten induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs). Durch Transfektion von Guide-RNAs und PE-Guide-RNAs (pegRNAs) in iPSC-Linien wollen wir gezielte Modifikationen erzeugen. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) wird verwendet, um editierte Zellen zu isolieren. Die Editierungseffizienz und Integrität der Zielsequenzen werden mittels digitaler PCR (dPCR) analysiert. Umfassende Sequenzierungen mit Illumina- und Nanopore-Sequenzierung werden durchgeführt, um On-Target-Editierungsergebnisse, einschließlich großer Deletionen, zu untersuchen. Während Illumina die Analyse kurzer Fragmente ermöglicht, kann Nanopore große Deletionen bis 10 kbp identifizieren. Zudem werden wir unsere Software, CRISPRnano, weiterentwickeln, um die Analyse von PE-Ereignissen zu verbessern, insbesondere bei der Erkennung unerwünschter Indels. Diese Forschung liefert wichtige Einblicke in die On-Target-Sicherheitsprofile von CRISPR/Cas9 und PE und trägt zur Entwicklung präziserer Genome-Editing-Werkzeuge für Forschung und Therapie bei.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen