Mechanismen des Holin-vermittelten Transports von Proteinen über die bakterielle Cytoplasmamembran

• Antragsteller: Professor Dr. Thomas Brüser
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung seit 2025
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 560834849

Lytische Phagen müssen am Ende ihres Vermehrungszyklus die Zellwand des Wirts hydrolysieren, um eine Lyse herbeizuführen und dadurch ihre Nachkommen freizusetzen. Dazu produzieren sie einerseits Endolysine, welche die Zellwand abbauen, und andererseits Holine, welche den Endolysinen den Zugang zur Zellwand ermöglichen. Die meisten Holine bilden dafür Löcher in der Cytoplasmamembran. Von diesen „kanonischen“ Holinen gibt es zahlreiche nicht verwandte Familien, von denen einige auch von Bakterien genutzt werden, um Proteine wie etwa Toxine ohne Lyse zu sekretieren. Derzeit geht man davon aus, dass Holine große zweidimensionale Aggregate (Rafts) ausbilden, die die Cytoplasmamembran am benötigten Zeitpunkt flächig auflösen. Bei der Arbeit am T4 Holin, einem Modellsystem für kanonische Holine, stellten wir aber unerwartet fest, dass eine größere Akkumulation von Holinen in der Membran für die Holin-Funktion nicht erforderlich ist. Stattdessen fanden wir heraus, dass kleinere Assemblierungen ausreichen, um die Freisetzung von Endolysin in das Periplasma zu ermöglichen, und dass Positionen der cytoplasmatischen Seite des Holins und darin insbesondere der N-terminalen amphipathischen Helix dafür essentiell sind. AlphaFold 3 sagt für das T4 Holin eine sinnvolle Ringstruktur voraus, die mit unseren Daten übereinstimmt, da die wichtige amphipathische Helix darin ein hydrophiles Loch bildet. Im beantragten Projekt soll nun geklärt werden, ob die Ring-abhängige Lochbildung wirklich so stattfindet. Mit gerichtetem Crosslinking werden wir Kontakte im Ring und dabei besonders auch die der amphipathischen Helix detektieren, wobei eine Kombination mit den “Loch-unterdrückenden” Austauschen klären wird, ob die amphipathische Helix im Zuge der Ringbildung wirklich nach innen klappt und dadurch das Loch bildet. Wir werden uns auch mit den ungewöhnlichen Holinen befassen, welche Bakterien für die nicht-lytische Sekretion von Toxinen nutzen. Diese Holine könnten ähnlich wie andere Holine eine wässrige Pore bilden, allerdings sagt AlphaFold 3 in diesen Fällen nicht sinnige Strukturen voraus. Ein Grund könnte sein, dass bei AlphaFold 3 die Biophysik von Membranen nicht berücksichtigt wird und insbesondere Interaktionen amphipathischer Helices von der Anwesenheit der Membran abhängen können. Wir werden daher den Mechanismus auch dieser Holine biochemisch und molekularbiologisch untersuchen. Da diese Holine ohne Zelllyse funktionieren, möchten wir auch wissen, ob ihre Porenbildung nur vorübergehend ist oder nicht. Die analysierten Holine sollen zudem gereinigt werden, um ihre Assoziationen auch mittels Kryo-EM zu charakterisieren. Eine definierte Pore könnte auch eine Substratselektivität von Holinen erklären, wobei der generell sehr hohe pI der Endolysine ein Selektionskriterium sein könnte, was wir untersuchen werden. Insgesamt wird dieses Projekt von sehr grundlegender Bedeutung für die Aufklärung der derzeit noch nicht verstandenen Holin-Mechanismen sein.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen