Der divergente PolII-Komplex von Paramecium: Initiierung, Pausing, und Elongation der Transkription ohne Rpb1 Heptad Wiederholungen und ohne NELF

• Antragsteller: Professor Dr. Axel Imhof; Professor Dr. Martin Simon
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung
• Förderung: Förderung seit 2025
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 564092193

Die Transkription von mRNA ist ein stark regulierter Prozess, bei dem die enzymatische Aktivität von PolII genau mit der Transkriptionseinheit und auch mit den biochemischen Modifikationen der mRNA verknüpft ist. Transkriptionsfaktoren und viele verschiedene Komplexe koordinieren die hierarchische Modifikation von Heptad-Wiederholungen in der C-terminalen Domäne von Rpb1, um die Regulierung des Transkriptionszyklus zu ermöglichen, der aus Initiation, promotornahem Pausieren und Elongation besteht. Darüber hinaus sind Chromatinmodifikationen entlang der Transkriptionseinheit an diesem Prozess beteiligt, die einerseits die PolII-Modifikation kontrollieren und andererseits unter der Kontrolle der PolII-Aktivität stehen. Dieses System ist für eine Vielzahl von Eukaryonten, von der Hefe bis zum Menschen, beschrieben worden. Hier analysieren wir ein sehr divergentes Transkriptionssystem. Bei unseren früheren Arbeiten am makronukleären Epigenom von Paramecium haben wir viele Chromatinmerkmale festgestellt, die sich von anderen Epigenomen unterscheiden. Dazu gehören die Verteilung von Nukleosomen, Histonmodifikationen und die PolII-Besetzung entlang von Genen. Diese Merkmale des Epigenoms werden von Unterschieden in der Transkriptionsmaschinerie begleitet. Vielen PolII-assoziierten Komplexen fehlen kanonische Komponenten, und Rpb1 fehlen Heptad-Wiederholungen in der C-terminalen Domäne, was ein hierarchisches Phosphorylierungsmuster unmöglich macht. Unser Plan ist es, die Kontrolle der mRNA-Transkription in diesem hochgradig divergenten System zu entschlüsseln und zu klären, ob eine unterschiedliche Phosphorylierung dieses divergenten Rpb1 auftritt und wie dies mit der Transkriptionsaktivität zusammenhängt. Wir werden die Modifikation/Phosphorylierung des serinreichen C-Terminus von Rpb1 durch Massenspektrometrie analysieren und PolII-assoziierte Komplexe durch Affinitätsreinigungen (AP-MS) charakterisieren. Unterschiedliche Modifikationen von Rpb1 können in Knockdown-Linien für verschiedene Komponenten analysiert werden, die für den Übergang vom Prä-Initiationskomplex zum promoternahen Pausieren (TFIIH, Mediator), die Freisetzung aus dem Pausieren (DSIF) und die Elongation (Spt6, Paf1) erforderlich sind. Die Knockdown-Linien werden mittels Pro-seq und ChIP-seq auf ihre genomische Verteilung, die Transkriptionsaktivität einzelner Gene, das promoter-proximale Pausieren und Veränderungen in der Chromatinlandschaft untersucht. Unsere molekulare Charakterisierung dieser Transkriptionsmaschinerie, die von allen bekannten Systemen abweicht, wird nicht nur zu unserem Verständnis der Evolution der Rpb1-CTD beitragen, sondern kann auch Erklärungen für die nicht-kanonische Transkription in multizellulären Organismen liefern, bei denen das beschriebene Muster der Rpb1-Phosphorylierung und Chromatinmarkierungen nicht den dogmatischen Regeln folgt.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen