In vivo und in vitro Analysen zur Funktion von LYSET für die skelettale und zelluläre Homöostase

• Antragsteller: Professor Dr. Thomas Braulke
• Fachliche Zuordnung: Orthopädie, Unfallchirurgie, rekonstruktive Chirurgie
• Förderung: Förderung seit 2025
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 564153147

Lysosomen spielen eine zentrale Rolle für den Abbau und das Recycling von unterschiedlichen Klassen von intra- und extrazellulären Makromolekülen durch ca. 70 lösliche Enzyme, die vom Golgi in Abhängigkeit von Mannose-6-Phosphat (M6P) Signalen und M6P-Rezeptoren zu den Lysosomen transportiert werden. Die M6P-Modifikation von Zuckerketten neu synthetisierter lysosomaler Enzyme wird durch einen hexameren N-acetylglucosamin-1-phosphotransferase (GNPT) Komplex im cis-Golgi katalysiert. Kürzlich haben wir durch genetische Screening-Verfahren ein neues Membranprotein, lysosomal enzyme trafficking factor (LYSET) identifiziert, das als GNPT Retentionsfaktor im Golgi fungiert. In Abwesenheit von LYSET wird GNPT in Lysosomen abgebaut, was die M6P-Markierung der lysosomalen Enzyme verhindert, ihre Sekretion und somit lysosomale Fehlfunktionen bedingt. Es wurden zwei nicht verwandten Familien mit Mutationen im LYSET Gen beschrieben, die durch progressive Skelettveränderungen gekennzeichnet sind, sich jedoch in ihren klinischen Symptomen und im Schweregrad der Erkrankung unterscheiden. Wir haben ein neues Lyset-knock-in (ki) Mausmodell generiert, das die homozygote Mutation (c.215dupA; p.Y72Ter) eines der LYSET-Patienten trägt und wollen a) die physiologische Bedeutung von Lyset für die Knochenentwicklung und das Remodeling in vivo und b) die Pathogenese der skelettalen Veränderungen untersuchen. Zusätzlich zur tiefgreifenden skelettalen Phänotypisierung sollen morphologische und funktionelle Untersuchungen an kultivierten Osteoblasten und Osteoklasten von Kontroll- und Lyset ki-Mäusen durchgeführt und mit den lysosomalen Proteomen und Sekretomen korreliert werden. Ein weiteres Ziel dieses Projektes ist auf die Rolle von M6P-unabhängigen Rezeptoren in LYSET-defizienten Zellen gerichtet, die den Transport von einzelnen lysosomalen Enzymen ohne M6P-Signale zu den Lysosomen ermöglichen und gewisse Abbaufunktionen aufrechterhalten. Eigene vorläufige Proteom-Daten lassen vermuten, dass Sortilin einen vielversprechenden Kandidaten für einen M6P-unabhängigen Cargo-Rezeptor darstellt. Deshalb ist geplant, den endogenen Sortilinspiegel durch CRISPR-Aktivierung oder stabile, induzierbare Überexpression in LYSET-defizienten Zellen zu erhöhen und in anschließenden Proteom-Analysen isolierter Lysosomen und von Sekretomen die Gesamtzahl, das Ausmaß und die Substratspezifität der transportierten lysosomalen Enzyme zu bestimmen sowie die Wirkung auf die Speicherung nicht abgebauter Moleküle zu evaluieren. Das vorliegende Projekt wird Einblicke 1. in Zelltyp-spezifische Funktionen von LYSET für die Knochenentwicklung und in Mechanismen geben, die den skelettalen Veränderungen in vivo zugrunde liegen, und 2.) die Bedeutung alternativer M6P-unabhängiger Rezeptoren am Beispiel von Sortilin als kompensatorisches Transportprotein aufzeigen, das auch translational anwendbar für andere Erkrankungen des M6P-Weges sein könnte.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Mitverantwortliche: Professorin Dr. Sabrina Jabs; Professor Thorsten Schinke, Ph.D.