Hefe-basiertes Expressionssystem für die Charakterisierung von Fettsäure-Photodecarboxylase (YesFAP)

• Antragstellerin: Professorin Dr.-Ing. Selin Kara
• Fachliche Zuordnung: Bioverfahrenstechnik
• Förderung: Förderung seit 2025
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 567047711

Die Fettsäure-Photodecarboxylase (FAP), die 2017 in der grünen Mikroalge Chlorella variabilis entdeckt wurde, ist ein einzigartiges Photoenzym, das zur Aufrechterhaltung seiner katalytischen Aktivität eine kontinuierliche Lichtabsorption benötigt und bei Dunkelheit inaktiv wird. FAP katalysiert die direkte Decarboxylierung von Fettsäuren und anderen Carbonsäuren in Kohlenwasserstoffe unter Verwendung von blauem Licht, wobei es ohne Coenzyme, selektiv und irreversibel arbeitet. FAP wird für die Synthese von biobasierten Kohlenwasserstoffen, wie erneuerbarem Diesel und therapeutischen Produkten, sowie für die enzymatische kinetische Auflösung sehr geschätzt. Trotz ihrer vielversprechenden Eigenschaften schränken mehrere Probleme ihre breite Anwendung ein: niedrige Expressionsraten, begrenzte Photostabilität, begrenzte Selektivität des Enzyms und die Notwendigkeit maßgeschneiderter Reaktionsbedingungen, um eine hohe Produktivität zu gewährleisten. Die größte Herausforderung ist die inhärent niedrige Expressionsrate von FAP und seine ineffiziente Produktion sowohl in nativen als auch heterologen E. coli-Systemen. Um diese Einschränkung zu beheben, muss man verstehen, wie man effektive Überexpressionsstrategien entwickelt, um eine hohe Enzymausbeute zu erzielen, was eine bedeutende grundlegende Wissenslücke darstellt. Das YesFAP-Projekt befasst sich mit dieser zentralen Herausforderung, indem es Komagataella phaffii als alternativen Wirt einsetzt. K. phaffii bietet mehrere Vorteile gegenüber dem klassischen E. coli-System: (i) verbesserte Proteinfaltung und -stabilität, was die komplexe Struktur von FAP unterstützt und die Ausbeute erhöht; (ii) direkte Sekretion von Proteinen in das Kulturmedium, was die Aufreinigung vereinfacht; und (iii) hohe Zelldichte und höhere Proteinausbeute.Ziel des YesFAP-Projekts ist die Schaffung einer innovativen Plattform unter Verwendung von K. phaffii für eine ertragreiche FAP-Expression, die in sechs Arbeitspakete (WPs) unterteilt ist: WP1 umfasst die Konstruktion von FAP-Expressionsvektoren mit dem AOX1-Promotor (Alkoholoxidase 1) zur Steigerung der Effizienz. WP2 konzentriert sich auf die Transformation von K. phaffii. WP3 umfasst die Extraktion, Reinigung und Strukturanalyse von FAP. WP4 testet die Decarboxylierungsfähigkeiten von FAP. WP5 führt in Zusammenarbeit mit dem Enzyme Engineering Lab der Universität Aarhus, Dänemark, Enzym-Engineering und vergleichende Expressionsanalysen in Hefe- und Bakteriensystemen. WP6 umfasst die Datenverarbeitung, die Erstellung von zwei Manuskripten über neue Beiträge und die Archivierung von Forschungsmaterialien. Zu den erwarteten Ergebnissen gehört ein tiefgreifendes Verständnis des Übergangs zu K. phaffii für die FAP-Expression, das neue Möglichkeiten für die Anwendung von FAP in der synthetischen Biologie und der industriellen Biotechnologie eröffnen und dadurch nachhaltige Enzymproduktionsmethoden fördern soll.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Dänemark
• Kooperationspartner: Professor Dr. Bekir Engin Eser