Charakterisierung und Entwicklung von Brückenrekombinasen für das großflächige Genome-Engineering

• Antragsteller: Dr. Gabriel Mello da Cunha Longo, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2025
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 568545862

Die Nutzung natürlich vorkommender Enzyme zur programmierbaren Modifikation von DNA-Sequenzen hat die biomedizinische Wissenschaft revolutioniert und den Weg für neue genetische Medikamente geebnet, indem pathogenetische Mutationen direkt korrigiert werden. Die genetische Heterogenität nahezu aller genetischen Erkrankungen erfordert maßgeschneiderte Genbearbeitungsansätze für jede Mutation, was es aus Kosten-, Zeit- und Skalierungsgründen unpraktisch macht, neue Behandlungen für jeden Patienten zu entwickeln. Eine Lösung ist das Einfügen funktionaler Kopien ganzer Gene an programmierten Stellen im Genom, um genetische Krankheiten mutationsunabhängig zu korrigieren. Die präzise und effiziente Einfügung großer DNA-Sequenzen bleibt jedoch eine große Herausforderung. Kürzlich wurden die IS110- und IS1111-Familien mobiler genetischer Elemente charakterisiert, was zur Entdeckung autonomer Systeme führte, die aus einer Rekombinase und einer nicht-kodierenden Brücken-RNA (bRNA) bestehen und gezielte DNA-Rekombination vermitteln. Diese Elemente ermöglichen eine standortspezifische großflächige DNA-Bearbeitung und sind aufgrund ihrer einfachen Umprogrammierbarkeit auf neue Zielorte vielversprechend, um die Herausforderungen der aktuellen Technologien zu überwinden. Allerdings ist die Brückenrekombinationsaktivität in menschlichen Zellen nicht effektiv, was Experimente zur Verbesserung der Effizienz motiviert. Schlage ich vor, effektivere Brückenrekombinasen zu entwickeln, die in menschlichen Zellen hoch funktional sind, indem ich die natürliche Vielfalt der IS110/1111-Elemente untersuche, um Brückenrekombinasen zu identifizieren, zu charakterisieren und weiter zu entwickeln, die eine programmierbare Einfügung großer DNA-Sequenzen in menschliche Genome ermöglichen. Die Ziele dieses Projekts sind: (1) Hunderte von Brückenrekombinasen zu screenen und die Programmierregeln zu definieren, während die zuvor charakterisierte IS621-Rekombinase (eIS621s) entwickelt wird, und (2) die Spezifität von nicht charakterisierten IS-Elementen und eIS621s zu untersuchen und ihr Potenzial als Geneditoren zur Einfügung korrigierender Transgene zu bewerten. Werde ich einen Hochdurchsatz-Test, um aktive IS-Elemente in E. coli zu screenen, und einen Ansatz der gerichteten Evolution entwerfen, um IS621 für höhere Rekombinationsaktivität in menschlichen Zellen zu entwickeln. Zudem werde ich die Sicherheitslandschaft der Enzyme untersuchen, indem ich off-target-Rekombinationen in menschlichen Zellen analysiere, um eine hohe Integrationsspezifität an der Zielstelle zu gewährleisten. Schließlich werde ich die Brückenrekombinasen-vermittelte Einfügung großer Sequenzen in einer Zelllinie validieren, die die häufigste genetische Mutation der Phenylketonurie (PKU) trägt, eine genetische Lebererkrankung, die durch Mutationen im PAH-Gen bedingt ist. Dieses Projekt darauf ab, das Potenzial dieses Mechanismus für die nächste Generation von Genom-Editoren zu nutzen.

• DFG-Verfahren: WBP Stipendium
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeber: Professor Dr. Benjamin Kleinstiver