Forward genetics in Thermoanaerobacter kivui: Transposasen als Problem und Lösung

• Antragsteller: Benjamin Zeldes, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Mikrobielle Ökologie und Angewandte Mikrobiologie
• Förderung: Förderung seit 2026
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 577588413

Thermoanaerobacter kivui ist eines der wenigen bekannten thermophilen Acetogene und hat aufgrund seines robusten Wachstums und seiner einfachen genetischen Manipulierbarkeit in letzter Zeit Interesse für industrielle Anwendungen geweckt. Als Mitglied zweier relativ wenig erforschter Bakteriengruppen (Thermophile und Acetogene) ist jedoch noch viel über seinen Stoffwechsel und Lebensstil unklar. Beispielsweise handelt es sich bei einem Viertel der Gene im Genom von T. kivui um „hypothetische” Gene mit unbekannter Funktion. Forward genetics-Techniken eignen sich ideal, um einer so großen Anzahl uncharakterisierter Gene Funktionen zuzuordnen, indem zunächst Stämme mit neuen Phänotypen identifiziert und anschließend sequenziert werden, um festzustellen, welche genetischen Mutationen für den Phänotyp verantwortlich sind. Adaptive Labor-Evolution (ALE) wurde verwendet, um T. kivui-Stämme mit neuen Phänotypen zu erzeugen, wie z. B. der Fähigkeit, auf Kohlenmonoxid (CO) zu wachsen. Die Genomsequenzierung der resultierenden evolvierten Stämme hat Mutationen identifiziert, die wahrscheinlich die neuen Phänotypen verursacht haben (Forward Genetics). Diese Sequenzierung offenbarte auch die Existenz eines hochaktiven Insertionssequenzelements (IS), das aus einem einzigen Transposase-Gen besteht, und vorläufige Experimente deuten darauf hin, dass die Insertion des IS-Elements Mutationen verursachen kann, die zu den neuen Phänotypen führen. Da Transposasen in der Regel eine bevorzugte Zielsequenz für die Insertion haben, ist es wahrscheinlich, dass die Ergebnisse der ALE durch eine Überrepräsentation von Mutationen in diesen Genomregionen verzerrt sind. Es gab auch Fälle, in denen IS-Elemente eine beabsichtigte genetische Manipulation gestört haben. Um festzustellen, inwieweit die Mutationsrate und die Endergebnisse von ALE-Experimenten durch IS-Elemente beeinflusst werden, werden die Transposasen von T. kivui mithilfe eines CRISPR-Genom-Editierungssystems entfernt. Durch den Einsatz von CRISPR können alle Genomkopien einer bestimmten Transposase gleichzeitig inaktiviert werden. Die Charakterisierung der resultierenden Transposase-Knockouts wird zu einem besseren Verständnis der Mutationsraten in T. kivui und deren Beeinflussung durch IS-Elemente führen. Die transposasefreien Stämme bieten außerdem einen unverfälschten Hintergrund für weitere ALE-Experimente und sind aufgrund ihrer verbesserten genetischen Stabilität für industrielle Anwendungen von Vorteil. Ein weiteres Ziel des Projekts ist die Entwicklung einer "zufälligen Transposon-Mutantenbibliothek" in T. kivui unter Verwendung einer synthetischen Transposase mit minimaler Insertionsverzerrung. Diese zufällige Mutantenbibliothek wird als Werkzeug für die anschließende Forward-Genetik-Forschung dienen, um die Funktion der vielen verbleibenden hypothetischen Gene im Genom von T. kivui zu identifizieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen