Konfokales Laserscanning-System mit Adaption eines Multiphotonenlasers
Final Report Abstract
Das Multiphotonen-Laserscanning-Mikroskop wird zu ca. 75% von den Arbeitsgruppen des Instituts für Entwicklungsbiologie (Hammerschmidt, Werr, Roth) genutzt, und zu 25% von verschiedenen anderen Arbeitsgruppen des SFB Festlegung von Zellverbänden und Zelltypspezifizierung, des SFB Molecular mechanisms regulating skin homeostasis, des Cologne Clusters of Excellence in Cellular Stress Responses in Aging-associated Diseases (CECAD), sowie des Zentrums für Molekulare Medizin Köln (ZMMK), jeweils nach Einführung in das Gerät durch einen Mitarbeiter der Arbeitsgruppe Hammerschmidt. Bei allen Projekten wird das Gerät zur Detektion fluorochrom-markierter Zellen oder Zellfortsätze in lebenden oder fixierten dicken Proben verwendet, was eine fluorochrom-schonende hohe Eindringtiefe erfordert, sowie zum Erstellen von Z-Stacks für dreidimensionale Gesamtüberblicke. In der Arbeitsgruppe Hammerschmidt wird das Gerät vorwiegend in den folgenden Projekten eingesetzt: 1. Neuroendokrine Kontrolle von Energie-Homeostase im Zebrabärbling: Studien in der Maus haben gezeigt, dass die Energie-Homeostase (Nahrungsaufnahme, Wachstum, Fettspeicherung, physikalische Aktivität, Energieverbrennung) unter neuroendokriner Kontrolle des hypothalamatischen Melanokortinsystems steht. Allerdings ist die Plastizität dieses Systems in Abhängigkeit vom metabolischen Zustand des Tieres wenig verstanden. Mittels BAC-Rekombination wurden transgene Zebrabärblinge hergestellt, in den verschiedene hypothalamatische Neurone mit verschiedenen Fluorochromen markiert sind. Diese sind teilweise Ca-abhängig (zur Visualisierung der neuronalen Aktivität), teilweise synapsengängig (zur Visualisierung neuronaler Vernetzung). Mittels in vivo Imaging werden Veränderungen in der Aktivität oder Verschaltung des Systems nach Hungern der Tiere und in verschiedenen Mutanten untersucht. 2. Hautentwicklung und kutane Wundheilung im adulten Zebrabärbling: vergleichende Studien der Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass kritische Schritte der Wundheilung wie Reepithelialisierung, Bildung von Granulationsgewebe und Vaskularisierung im Zebrabärbling ähnlich ablaufen wie in Säugern. Allerdings verläuft die Wundheilung im Fisch ohne Narbenbildung. In vivo Imaging von transgenen Fischen mit fluorochromer Markierung von epidermalen Keratinozyten, dermalen Fibroblasten, Neutrophilen, Makrophagen oder Endothelzellen dient zur genauen Analyse dieser verschiedenen Prozesse in wildtypischen Fischen sowie in verschiedenen Mutanten oder transgenen Linien, in denen die Wundheilung beeinträchtigt ist. 3. Knochenentwicklung im Zebrabärbling: es wurden verschiedene Mutanten mit reduzierter oder verstärkter (ektopischer) Knochenbildung isoliert und (teilweise) kloniert. Außerdem wurden (in anderen Laboratorien) transgene Linien generiert, in den knochenbildende und knochenabbauende Zellen (Osteoblasten und Osteoklasten) fluorochrom markiert sind. Mittels in vivo Imaging wird untersucht, inwieweit die Knochendefekte in den verschiedenen Mutanten auf veränderte Osteob(k)lasten-Differenzierung oder -Aktivität zurückzuführen sind. Auf diese Weise konnte die Arbeitsgruppe kürzlich nachweisen, dass die durch Mutationen im Retinsäure-metabolisierenden Enzym Cyp26b1 sowohl im Menschen als auch im Zebrabärbling hervorgerufene Craniosynostose (Fusion der Schädelplatten) durch eine verfrühte Differenzierung von Osteoblasten zu Osteozyten bedingt wird. 4. Morphogenese der Schlupfdrüse des Zebrabärblings: Die Vorläuferzellen der Schlupfdrüse stammen vom vorderen dorsalen Mesoderm ab. Nach Ende der Gastrulation durchbrechen sie als mehrschichtiger Zellverband die basale Schicht der Epidermis, um anschließend in einen einschichtiges Verband überzugehen und als solcher zwischen basaler und äußerer Schicht der Epidermis zu ihrem Zielgebiet auf dem Dottersack zu wandern. Antisense-getriebene Geninaktivierungsanalysen zeigen, dass diese verschiedenen morphogenetischen Prozesse von verschiedenen membranständigen Proteasen und deren Inhibitoren abhängen, welche sowohl in den Schlupfdrüsen selbst als auch in der inneren oder äußeren Hautschicht hergestellt werden. In vivo Imaging von Embryonen mit GFP- oder RFP-markierten Schlupfdrüsenzellen von wildtypischen, knockdown und mosaiken Embryonen soll Aufschluß über die genauen zellulären Mechanismen der Morphogenese sowie ihre Veränderungen nach verschiedenen geben. In der Arbeitsgruppe Werr wird das Gerät vorwiegend für Kolokalisationsstudien des GFP-markierten Transkriptionsfaktors Dornröschen mit den Venus-markierten Transkriptionsfaktoren STM und CUC2 im Embryo von Arabidopsis thalana verwendet, sowie zur Analyse von Reporter-knockout-Linien im Wuschel Homeoboxgen wox13 im Blasenmützenmoos physcomitrella patens. In der Arbeitsgruppe Roth / Panfilio / Lynch wird das Gerät zur vergleichenden Analyse epithelialer Morphogenese und dorsoventraler Musterbildung während der Frühentwicklung verschiedener holometaboler und hemimetaboler Insekten verwendet.
Publications
- The ENTH domain protein Clint1 is required for epidermal homeostasis in zebrafish. Development. 2009 Aug;136(15):2591-600
Dodd ME, Hatzold J, Mathias JR, Walters KB, Bennin DA, Rhodes J, Kanki JP, Look AT, Hammerschmidt M, Huttenlocher A
- Genetic analysis of fin development in zebrafish identifies furin and hemicentin1 as potential novel fraser syndrome disease genes. PLoS Genet. 2010 Apr 15;6(4)
Carney TJ, Feitosa NM, Sonntag C, Slanchev K, Kluger J, Kiyozumi D, Gebauer JM, Coffin Talbot J, Kimmel CB, Sekiguchi K, Wagener R, Schwarz H, Ingham PW, Hammerschmidt M
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Li Y, Laue K, Temtamy S, Aglan M, Kotan LD, Yigit G, Canan H, Pawlik B, Nürnberg G, Wakeling EL, Quarrell OW, Baessmann I, Lanktree MB, Yilmaz M, Hegele RA, Amr K, May KW, Nürnberg P, Topaloglu AK, Hammerschmidt M, Wollnik B
- Zebrafish in endocrine systems: recent advances and implications for human disease. Annu Rev Physiol. 2011 Mar 17;73:183-211
Löhr H, Hammerschmidt M
