Radical catalysis in Fe/S cluster dependent dehydratases
Final Report Abstract
In diesem Projekt wurden die Strukturen und Mechanismen von atypischen Dehydratasen untersucht. Atypische Dehydratasen treten in zahlreichen anaerob lebenden Bakterien auf und erlauben diesen Aminosäuren zu vergären. Atypisch sind die katalysierten Dehydratisierungen, da das zu entfernende Proton in der nicht aktivierten β-Position liegt und daher eine geringe C-H Acidität (pKa ~ 26) aufweist. Die Acidität des β-Protons kann durch einen vorhergehenden Elektronentransfer und Ausbildung eines Ketylradikalaions auf der Thioestergruppe des Substrats deutlich erhöht werden. Die dazu notwendige Reduktion des Thioesters benötigt Elektronen bei sehr tiefen Redoxpotenzialen. Da „physiologische“ Elektronen nicht hinreichend energetisch sind, um die Ketylradikalanionen zu erzeugen, wird in den untersuchten Dehydratasen die Energie von ATP in einer ATPase-Komponente umgewandelt, um einen Elektronentransfer gegen den Redoxpotenzial-Gradienten zu ermöglichen. Wie die Energie des ATPs für den Elektronentransfer genutzt und gezielt das Ketylradikal-Anion gebildet wird, war vor dem Start unserer Arbeiten noch unverstanden. Wir konnten die Kristallstrukturen der zwei Komponenten der (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA- Dehydratase aus Clostridium difficile in verschiedenen Zuständen bestimmen. Die eigentliche Dehydratase-Komponente ist ein Heterodimer in dem beide Untereinheiten eine ähnliche Faltung zeigen und im Schnittpunkt ihrer drei Domänen ein [4Fe-4S]-Zentrum mit drei Cysteinen koordinieren. Während in der β-Untereinheit ein terminaler Sulfido-Ligand am nicht-Cys koordinierten Fe-Ion gefunden wurde, liegt in der α-Untereinheit ein leicht austauschbarer Hydroxid-Ligand an der vierten Koordinationsstelle des nicht-Cys koordinierten Fe-Ions. Das aktive Zentrum konnte in einer Kristallstruktur mit dem Substrat (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA in der α-Untereinheit definiert werden, wobei das Substrat mit der Carbonyl-Gruppe des Thioesters an die offene Koordinationsstelle des [4Fe-4S]-Zentrum bindet. Dies ermöglicht die Ausbildung eines Ketylradikalanions durch einen innersphere Elektronentransfer zwischen dem Eisen-Schwefelzentrum und dem Substrat. Auf der Grundlage des vorhergehenden spektroskopischen Nachweises von katalytisch-kompetenten Ketylradikalen im Umsatz der (R)-2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase und der Struktur des Enzyms mit Substrat konnte ein Mechanismus der Aktivierung und Dehydratisierung vorgeschlagen werden in dem das Enzym durch einen Elektronenrecycling-Mechanismus die beobachteten 10.000 Umsätze erreichen kann, bevor es eine weitere ATP-abhängige Aktivierung braucht. Kristallstrukturen der ATPase-Komponente mit ATP, ADPNP und ohne Nukleotid im reduzierten Zustand zeigen die Nukleotid-abhängige Schließung der ATP-Bindetasche. Durch Vergleich mit der oxidierten Struktur des Aktivators von (R)-2-Hydroxyglutaryl-CoA-Dehydratasen konnten wahrscheinlich Redox-abhängige Änderungen in der Konformation eines konservierten Arginin-Restes nahe am [4Fe-4S]-Zentrum der ATPase nachgewiesen werden. Zusammen mit biochemischen Untersuchungen der Nukleotid-abhängigen ATPase- und Dehydratase-Komplexbildung wurde ein Reaktionsnetzwerk für den ATP-abhängigen Elektronentransfer zwischen ATPase und Dehydratase vorgeschlagen.
Publications
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(2011). "Structural basis for reductive radical formation and electron recycling in (R)-2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratases". J. Amer. Chem. Soc133(12): 4342-4347
Knauer S.H., Buckel W., Dobbek H.
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(2012). "Enzyme catalysed radical dehydration of hydroxy acids". Biochem. Biophys. Acta 1824(11):1278-1290
uckel W., Zhang J., Friedrich P., Parthasarathy A., Li H., Djurdjevic I., Dobbek H., Martins B.M.
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(2012). "On the ATP-dependent activation of the radical enzyme (R)-2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratases". Biochemistry 51(36):7040-7042
Knauer S.H., Buckel W., Dobbek H.
