Development of targeted retroviral vectors pseudotyped with the Tupaia paramyxovirus glycoproteins
Gastroenterology
Final Report Abstract
Lentivirale Vektoren sind für viele Gentherapie-Anwendungen wichtig, weil sie eine Langzeitexpression des Transgens vermitteln können und sowohl sich teilende als auch sich nicht teilende Zellen transduzieren können. Seit einiger Zeit ist es möglich, Lentiviren mit den Glykoproteinen des Masernvirus (MV) zu pseudotypisieren und dadurch eine zielgerichtete Transduktion zu erreichen. Ein Nachteil der MV-Vektoren besteht darin, dass fast alle Patienten MV-Antikörper aufweisen, die wahrscheinlich eine systemische Verabreichung der Vektoren behindern. Das Ziel dieser Studie war, zu prüfen, ob sich die Tupaia paramyxovirus (TPMV) Glykoproteine, die, ähnlich wie beim MV, gentechnisch so verändert werden können, dass sie eine zielgerichtete Transduktion ermöglichen, auch zur Pseudotypisierung von Lentiviren eignen. Weil TPMV nicht humanpathogen ist, sind keine Antikörper in unbehandelten Patienten zu erwarten. Für die zielgerichtete Transduktion wurde ein CD20-Einzelkettenantikörper verwendet. Um die Inkorporation der TPMV-Glykoproteine zu verbessern, wurde eine systematische Modifikation der zytoplasmatischen Domänen der Glykoproteine durchgeführt. Nach biochemischer Charakterisierung wurde untersucht, inwieweit die modifizierten Glykoproteine in lentivirale Vektoren inkorporiert werden. Dabei zeigte sich, dass die höchsten Vektortiter mit einem um 80 Aminosäuren trunkierten H-Protein und einem um 32 Aminosäuren trunkierten F-Protein erreicht wurden. Mit den neu hergestellten Vektoren konnten selektiv CD20-positive Zellen in einer gemischten menschlichen Zell-Population transduziert werden. Es zeigte sich auch, dass ruhende primäre B-Zellen, eine eigentlich sehr schwer transduzierbare Zellpopulation, effizient transduziert werden konnten. Mit Neutralisierungsassays konnte gezeigt werden, dass die TPMV-pseudotypisierten lentiviralen Vektoren nicht durch menschliche Seren, die MV- Antikörper enthalten, neutralisiert werden. Trotz vieler Optimierungsversuche lagen die maximal erzielten Virustiter nur im Bereich von 106 transduzierten Einheiten pro Milliliter, ein Nachteil, der die klinische Verwendung der Vektoren aktuell noch einschränkt. Überraschenderweise zeigte sich bei der Verwendung eines neu hergestellten Antikörpers gegen die extrazelluläre Domäne des F-Proteins, dass zusätzlich zur bekannten proteolytischen Aktivierung in ein F1- und F2-Protein eine weitere Spaltung erfolgt. Das neu identifizierte F1a- Fragment war sowohl im Überstand infizierter Zellen als auch in TPMV-Virionen nachweisbar. Die Spaltstelle wurde näher charakterisiert und wird durch Cystein-Proteasen gespalten. Insgesamt scheint die F-Protein Prozessierung also deutlich komplexer als bisher bekannt zu sein. Zusammenfassend konnten erfolgreich lentivirale Vektoren mit den TPMV-Glykoproteinen pseudotypisiert werden und gezeigt werden, dass eine zielgerichtete Transduktion auch in Anwesenheit MV-neutralisierender humaner Seren möglich ist. Damit steht für die Zukunft ein attraktives Vektorsystem zur Verfügung, wenn die zielgerichtete Transduktion ausgewählter Zelltypen im Rahmen von Gentherapieversuchen erforderlich ist.
Publications
- Targeted lentiviral vectors pseudotyped with the Tupaia paramyxovirus glycoproteins. Gene Ther. (2013) 20, 16 - 23 [Epub ahead of print 2012 Jan 5.]
Enkirch T, Kneissl S, Hoyler B, Ungerechts G, Stremmel W, Buchholz CJ, Springfeld C
(See online at https://doi.org/10.1038/gt.2011.209)
