Zeitaufgelöstes Fluoreszenzimaging zum selektiven Nachweis von NAD(P)H- bzw. FAD-abhängigen Enzymen am Beispiel zellvermittelter Pathogenzerstörung
Final Report Abstract
In der vergangenen Förderungsperiode des Projektes konnte gezeigt werden, dass NAD(P)H-FLIM ermöglicht unter Zellkultur Bedingungen die Kinetik der Aktivierung von funktionellen ROS-massivproduzierenden Enzymen zu visualisieren, d.h. hauptsächlich die Phagocytose-NADPH Oxidase – NOX2 (auch PHOX genannt). Die Experimente deuten darauf hin, dass das für die typische Fluoreszenzlebendauer von NADPH (Erkennungsmerkmal) verantwortliches Molekül, das gp91 ist, da dieselbe Fluoreszenzlebensdauer von NADPH sowohl in für die NOX2 spezifisch aktivierten neutrophilen Granulocyten als auch in Zellen von Nicotiana tabacum gemessen wurde, wo gezielt die „pflanzliche“ NADPH Oxidase aktiviert wurde. Der gemeinsame Nenner dieser zwei verwandten ROS- produzierenden Enzyme und aller Enzyme aus der NOX-Familie ist das membrangebundene Protein gp91. Diese Hypothese wird zusätzlich mittels trFAIM (zeitlich aufgelöstes Fluoreszenzanisotropie Imaging) bestätigt. Somit können NAD(P)H-FLIM und -trFAIM in der Visualisierung der Aktivierung aller Mitglieder der NOX-Familie eingesetzt werden. Mit Hilfe von enzym-spezifischem NAD(P)H-FLIM sind wir zum ersten Mal in der Lage die Aktivierung von NOX2 in neutrophilen Granulocyten als dynamische (ein Bild/30 s) und ortsspezifische Antwort zu dem Kontakt mit Pathogenen (Aspergillus fumigatus), d.h. während der Phagocytose, zu identifizieren. Was die Einsetzbarkeit von FLIM in der Visualisierung physiologischer und pathologischer Prozesse in lebenden Organmodellen oder gar im lebenden Organismus anbetrifft, konnte in Hirnschnitten und im Hirnstamm anästhesierten Mäuse gezeigt werden, dass es möglich ist die neuronale Ca- Konzentration mittels FLIM-FRET bei einer Aufnahmegeschwindigkeit von ein z-Stack (256x256x7 voxel) / 90 s zu monitoren. Weiterhin wurden die Vorteile der Nutzung eines optischen parametrischen Oszillators (OPO) als Anregungsquelle für Intravitalmikroskopie systematisch untersucht. Diese zwei Studien stellen die Grundlage für erfolgreiche NAD(P)H-basierte FLIM-Experimente im lebenden Gewebe des Zentralnervensystems.
Publications
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Expanding Two-Photon Intravital Microscopy to the Infrared by Means of OPO, Biophys. J., 2010, 98(4), 715-723
J. Herz, V. Siffrin, A.E. Hauser, A.U. Brandt, T. Leuenberger, H. Radbruch, F. Zipp, R. Niesner
