Exploring ligand-protein interaction in G protein-coupled receptors using surface-enhanced infrared absorption spectroscopy of membrane protein monolayers on nano-structured gold surfaces
Final Report Abstract
Mit Hilfe von oberflächenverstärkter Infrarot-Absorptions-Spektroskopie (surface-enhanced infrared absorption spectroscopy, SEIRAS) auf Goldoberflächen versuchten wir Konformationsänderungen eines Rezeptors in einem für Ligandenbindung zugänglichen Protein-Monolayer zu verfolgen. Die SEIRAS-Technik wurde zunächst für Membranproteine optimiert, um eine funktionelle Protein-Monolayer zu erzeugen. Um die inhärente strukturelle Instabilität der G Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) im Griff zu bekommen, wurde der Rezeptor für SEIRA Messungen in diskoidale Lipoprotein-Partikeln inkorporiert. Diese Partikeln bieten dem Rezeptor eine stabilisierende Lipid-Umgebung, sind löslich und können spezifisch an die SEIRA Oberfläche gebunden werden. Der an der Oberfläche gebundene Rezeptor behält seine Funktionalität, ist von beiden Seiten zugänglich, und seine Aktivierung kann trotz der intrinsisch sehr kleinen Signalintensität des Monolayers mit SEIRA Differenzen-Spektroskopie verfolgt werden. Die Durchführbarkeit dieses Ansatzes wurde am Beispiel von prototypischen GPCR Rhodopsin gezeigt, an dem die bei der durch Licht getriggerten Rezeptoraktivierung ablaufenden molekularen Veränderungen mit SEIRA Differenzenspektroskopie bis auf die Ebene einzelner Aminosäurenseitenketten detektiert werden konnten. Im zweiten Schritt wollten wir diese Methode auf Liganden-aktivierte GPCR übertragen, aber aufgrund der Schwierigkeiten in Expression und Aufreinigung von der GPCRs, auf die unsere Kollegen in New York gestoßen waren, wurde der Schwerpunkt dieses Teils des Projektes verlagert. Deshalb untersuchten wir in einem weiteren Ansatz auf molekularer Ebene die Aktivierungsmechanismen des Photorezeptors Rhodopsin als einem Prototyp der Klasse A GPCRs. Allgemeine Aspekte der Aktivierung des Rhodopsins können auf andere GPCRs übertragen werden. Zuerst untersuchten wir den spezifischen Einfluss von Lipid-Umgebung auf die einzelnen Photointermediate während der Aktivierung des Rhodopsins in Membranen. Mit Hilfe von Fourier-Transform Infrarot (FTIR) Differenzenspektroskopie konnten wir die thermodynamischen Eigenschaften der Intermediaten in einer künstlichen Lipid-Membran bestimmen. Dies erlaubte uns weiterhin eine spezifische Stabilisierung eines sonst fast ausschließlich transient gebildeten Intermediates, Meta IIa, und dessen strukturelle und funktionelle Charakterisierung. Durch FTIR Spektroskopie an Rhodopsin mit ortsgerichtet eingebauten IR-aktiven Azido-Labels wurden lokale Veränderungen der elektrostatischen Umgebung innerhalb des Proteins bei der Rezeptor-Aktivierung detektiert und die damit verbundenen Helixbewegungen charakterisiert. Zuletzt untersuchten wir den Einfluss von Tyr223 und Ala132, zwei hochkonservierte Aminosäuren im Bereich des cytoplasmatisches Ionic Loc des Rhodopsins, auf den Rezeptor Aktivierungsweg. Mit Hilfe von FTIR Differenzenspektroskopie konntet die stabilisierende Wirkung dieser Seitenketen auf aktive Rezeptorkonformation nachgewiesen werden.
Publications
- (2008) Resolving voltage-dependent structural changes of a membrane photoreceptor. Proc Natl Acad Sci USA 105: 12113-12117
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- (2010) Role of Tyr223 in opening and closing of the ionic lock in rhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:19861-19866
Goncalves J, South K, Ahuja S, Zaitseva E, Opefi C, Eilers M, Vogel R, Reeves P, Smith S
- (2010) Sequential rearrangement of interhelical networks for rhodopsin activation in membranes: the Meta IIa conformational substate. J Am Chem Soc 132: 4815-4821
Zaitseva E, Brown MF, Vogel R
- (2010) Surface-enhanced FTIR difference spectroscopy on a membrane protein monolayer using soluble lipoprotein particles as carriers. Biophys J 99: 2327-2335
Zaitseva E, Saavedra M, Banerjee S, Sakmar TP, Vogel R
- (2010) Tracking G protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature 464: 1386-1389
Ye S, Zaitseva E, Caltabiano G, Schertler GFX, Sakmar TP, Deupi X, Vogel R
