Beeinflussung der Poly (ADP-Ribosyl)ierung durch toxische Metallionen: Aufklärung der molekularen Wirkungsmechanismen
Final Report Abstract
Nickel, Cadmium, Arsen und ihre Verbindungen sind beim Menschen und im Tierversuch kanzerogen. Nach wie vor sind jedoch die zugrundeliegenden Mechanismen nicht vollständig geklärt; allerdings weisen Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe wie auch anderer Autoren auf eher indirekte Wirkungsmechanismen wie die Beeinflussung von DNA-Reparaturprozessen hin. Im Rahmen dieses Projektes wurde der Einfluss ausgewählter kanzerogener Metallverbindungen auf die Poly(ADP-Ribosyl)ierung untersucht. Hierbei handelt es sich um eine posttranslationale Modifikationsreaktion, die bei der DNA-Schadenserkennung sowie bei unterschiedlichen DNA-Reparaturmechanismen eine Rolle spielt und damit essentiell für den Erhalt der genomischen Stabilität ist. Aufbauend auf früheren Beobachtungen, dass diese Reaktion bereits bei sehr niedrigen Konzentrationen an Arsenit, Nickel und Cadmium inhibiert wird, wurden die molekularen Wechselwirkungen, die dieser Inhibierung zugrunde liegen, weiter aufgeklärt. Zunächst wurden die Cytotoxizität, die Aufnahme und die intrazelluläre Verteilung der jeweiligen Metallverbindungen bestimmt. Das Ausmaß an Poly(ADP-Ribose)-Polymeren (PAR) wurde fluoreszenzmikroskopisch nach Stimulation mit H2O2 oder Methylmethansulfonat quantifiziert; DNA-Strangbrüche wurden durch „Alkaline Unwinding" nachgewiesen. Ferner wurde die Interferenz der kanzerogenen Metallverbindungen mit der Genexpression und der Stabilität der beiden hauptsächlich in den PAR-Metabolismus involvierten Proteine PARP-1 und PARG sowie der zelluläre Gehalt an NAD+ untersucht. Darüber hinaus wurden Untersuchungen zur direkten Wechselwirkung der einzelnen Metallverbindungen mit isolierten Proteinen des Poly(ADP-Ribose)-Metabolismus sowie in Kernextrakten durchgeführt. Schließlich wurde untersucht, welche Teilschritte der Poly(ADP-Ribose)-Synthese betroffen sind. Bei allen untersuchten Verbindungen liegt dieser Hemmung eine verminderte Synthese von Poly(ADP-Ribose)-Polymeren, die hauptsächlich durch PARP-1 katalysiert wird, zugrunde. Die hierfür verantwortlichen Wechselwirkungen sind jedoch komplex und für die jeweiligen Metallverbindungen unterschiedlich. Die Ergebnisse zeigen sowohl Interferenzen mit der Aktivierbarkeit des Enzyms durch vorhandene DNA-Schäden als auch mit den daran anschließenden Schritten der Poly(ADP-Ribose)-Synthese, bei der durch die katalytische Domäne der PARP-1 Poly(ADP-Ribose)-Einheiten auf entsprechende Akzeptormoleküle übertragen werden. Bezüglich der potentiellen Zielstrukturen innerhalb der PARP-1 weisen unsere Studien im Fall von Cadmiumionen auf eine Bindung an für die Katalyse essentiellen Thiolgruppen außerhalb der Zinkfinger-Strukturen in der katalytischen Domäne von PARP-1 hin. Für Nickelionen hingegen konnte eine direkte Bindung an ein synthetisiertes Peptid, welches der im N-Terminus der PARP-1 vorhandenen Zinkfingerstruktur Zf1 entspricht, gezeigt werden; hier findet möglicherweise ein Zinkaustausch statt. Im Fall von Arsenit konnte die Diskrepanz zwischen der Inaktivierung der Poly(ADP-Ribose)-Synthese bei extrem niedrigen Konzentrationen im zellulären System und der Hemmung der isolierten PARP-1 erst bei höheren Konzentrationen nicht vollständig aufgeklärt werden; hier wurden umfangreiche Untersuchungen zur potentiellen Rolle von Metallothioneinen durchgeführt, die jedoch noch nicht abgeschlossen sind. Zusammenfassend liefern die Ergebnisse wesentliche neue Erkenntnisse bezüglich der molekularen Wirkungsmechanismen kanzerogener Metallverbindungen und liefern wichtige Hinweise für die Risikobewertung entsprechender Expositionen.
Publications
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(See online at https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2012.11.009)
