Vector-targeting CLP-vaccines against tick-transmitted infections
Final Report Abstract
Zecken als blutsaugende Ektoparasiten sind Vektoren für viele Mikroorganismen, darunter Borrelien als Erreger der Lyme-Krankheit. Zeckenspeichel enthält zahlreiche Anti-Wirtsfaktoren, u.a. Immunsuppressiva, die der Zecke ihre ausgedehnten Blutmahlzeiten ermöglichen und gleichzeitig die Transmission zeckenübertragbarer Mikroben fördern. Borrelia burgdorferi in Nordamerikanischen Ixodes scapularis Zecken rekrutieren zudem spezifisch das sekretorische, Cystein-reiche Zeckenspeichelprotein Salp15 als Schutzmantel auf ihr Oberflächenprotein OspC. Salp15 Orthologe wie Iric-1 aus I. ricinus, Hauptvektor für eurasische Borrelien (u.a. B. afzelii), sowie tick histamine release factor (tHRF) haben vermutlich ähnliche Funktionen. Diese Zeckenproteine bieten sich daher als Zielantigene für neuartigeVakzine an, die Zeckenbefall und damit verbundene Übertragung von Mikroorganismen generell, sowie spezifisch die Transmission von Borrelien reduzieren könnten. Ein Hindernis für solche Vakzine ist die immunsuppressive Aktivität dier Zeckenproteine; noch grundlegender ist das Fehlen rekombinanter Expressionsysteme für Salp15 Orthologe, die mehr Protein liefern als die winzigen Mengen aus dem bislang einzig etablierten Insektenzellsystem. Die Immunogenität von Antigenen kann durch Präsentation auf einem partikulären Nanoträger stark erhöht werden; besonders potent sind von Hepatitis B Virus (HBV) abgeleitete ikosahedrale Kapsidartige Partikel (Capsid-like particles/CLPs). Zunächst für die genetische Fusion von kurzen Peptiden in das sequenzinterne, immundominante c/e1 Epitop im HBV Kapsidprotein (HBc) entwickelt, können so auch ausgewählte komplette Proteine nativ präsentiert werden - allerdings nur, wenn ihre 3D-Struktur in die beiden Akzeptorstellen im HBc passt, was - wie im Projekt gezeigt - nur für tHRF zutrifft. Die Struktur der Salp15 Proteine war dagegen gänzlich unbekannt. Zunächst wurde daher (Nassal) das "SplitCore" System als deutlich vielseitiger anwendbarer Antigen- Träger weiterentwickelt. Kernpunkt ist ein in c/e1 zweigeteiltes HBc, wodurch die ein- statt beidseitige Fusion mit Fremdproteinen ermöglicht und sterische Einschränkungen drastisch vermindert werden (Patente erteilt). Allerdings führte bereits die Expression in E. coli von Wildtyp Salp15 und Iric-1 (u.a. kloniert von Wallich) per se ebenso wie zahlreiche HBc-Fusionkonstrukte zu völlig unlöslichem Protein. Sekretorische Expression in zellwandlosen Bakterien, Baculovirus-transduzierten Insektenzellen oder Leishmania tarentolae ergab nur geringste Ausbeuten. Die erneute Fokussierung auf E. coli führte schließlich zu Fusionen mit dem bakteriellen DsbA Protein, wodurch Wildtyp-Salp15 und Iric-1 sowie zahlreiche Varianten (einschließlich Cys-Mutanten) in löslicher Form präparativ zugänglich wurden. Die freien Zeckenproteine konnten daraus proteolytisch in ausreichender Menge für initiale NMR-Strukturanalysen erhalten werden, die Varianten ermöglichten die Kartierung der Epitope zweier monoklonaler anti-Salp15 Antikörper (Wallich) und der OspC-Binderegionen auf Salp15 und Iric-1. Cys-freie Varianten konnten erfolgreich auf SplitCore CLPs präsentiert werden. In Mäusen (Wallich) induzierten diese wie auch tHRF-CLPs hochtitrige Zielantigen-spezifische Antikörper; die Antikörper gegen Salp15 und Iric-1 blockierten in vitro die OspC-Bindung. Schließlich wurde, gemeinsam mit dem Parasitologen M. Voordouw (Universität Neuchatel; mit einem der wenigen weltweit dafür geeigneten Labors), die Schutzwirkung der Antikörper gegen Befall mit I. ricinus und Übertragung von B. afzelii in die Maus und zurück in naive Zecken in vivo evaluiert (Wallich, Nassal, Voordouw). Unerwartet im Licht zwischenzeitlich publizierter Daten von US-Kollegen über die Wirksamkeit Salp15- oder tHRF-basierter Vakzinierung gegen Nordamerikanische Zecken und Borrelien konnten wir keinen signifikanten Einfluss der Impfungen (allein, oder in Kombination) auf irgendeinen der untersuchten Parameter feststellen. Angesichts der nachweislich vorhandenen hochtitrigen Anti-Zeckenprotein Antikörper in den vakzinierten Mäusen legt dies nahe, dass die US- Daten nur auf die Nordamerikanischen Zecken und ihre Borrelien zutreffen; alternativ könnten auch Antikörper gegen die drei ausgewählten Zeckenproteine generell unzureichend sein, um die fördenden Eigenschaften von Komplett-Zeckenspeichel auf Blutmahlzeit und Borrelien-Transmission zu neutralisieren. Diese Daten stellen nicht zwangsweise das gesamte Anti-Zecken-Vakzine Konzept in Frage; ein direkter Nachweis seiner generellen Tragfähigkeit wird aber ein wesentlich tieferes Verständnis der Zeckenspeichelkomponenten und ihrer Eigenschaften erfordern als derzeit verfügbar.
Publications
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SplitCore: An exceptionally versatile viral nanoparticle for native whole protein display regardless of 3D structure. Sci Rep. 2011; 1:5
Walker A, Skamel C, Nassal M
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University Hospital Freiburg. Split-core-particles for the presentation of foreign molecules, especially for vaccine applications, and method for their production. European Patent: EP 2059525 B1 20111221 (DE); US Patent: US 8282932 B2
Nassal M, Walker A, Skamel C
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Versatile Roles of CspA Orthologs in Complement Inactivation of Serum-Resistant Lyme Disease Spirochetes. Infect Immun Dec 2013, 82 (1) 380-392
Hammerschmidt C, Koenigs A, Siegel C, Hallström T, Skerka C, Wallich R, Zipfel PF, Kralczy P
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Soluble cysteine-rich tick saliva proteins Salp15 and Iric-1 from E. coli. FEBS Open Bio. 2015; 5:42-55
Kolb P, Vorreiter J, Habicht J, Bentrop D, Wallich R, Nassal M
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SplitCore: advanced nanoparticulate molecular presentation platform based on the hepatitis B virus capsid. Ch. 12, 22 S., in: Viral Nanotechnology, Ed. Y Khudyakov & P Pumpens. Boca Raton, CRC Press, 2015. ISBN 9781466583528
Kolb P, Nguyen TTA, Walker A, Nassal M
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Whole-chain tick saliva proteins presented on hepatitis B virus capsid-like particles induce high-titered antibodies with neutralizing potential. PLOS One 10(9): e0136180
Kolb P, Wallich R, Nassal M.
