Physiological function of nucleoside / nucleobase transport and catabolism
Final Report Abstract
Im Projektteil die weitergehende Analyse des plastidären Nukleobasentransports betreffend konnten eingehende Struktur-Funktionsbeziehungen am plastidären Nukleobasentransporter PLUTO untersucht werden. So konnten die Substratbindestellen und für den Transport wichtige Aminosäurereste identifiziert werden. Da PLUTO knockout-Mutanten eine leicht erhöhte Sensitivität gegenüber toxischem 5-Fluoruracil und erhöhte Uracil-Gehalte aufwiesen, ansonsten aber phänotypisch unauffällig waren wurde nach Funktionshomologen zu PLUTO gesucht. Im Rahmen dieser Untersuchungen konnten mit den Arabidopsis „Nucleobase-Ascorbate Transporter“ (NAT) 3 und NAT12 erstmals pflanzliche Vertreter dieser Proteinfamilie charakterisiert werden. Beide Proteine fungieren als Uracil, Guanin, Adenin Transporter, sind jedoch an der Plasmamembran lokalisiert. Struktur-Funktionsanalysen von NAT12 ergänzten die Untersuchungen. Ob Funktionshomologe zu PLUTO existieren bliebt nach unseren Untersuchungen allerdings fraglich. Die Funktion extrazellulärer Nukleoside betreffend, konnte anhand von ENT3:NSH3 Doppelmutanten, denen das Haupt-Nukleosidimportsystem sowie die extrazelluläre Nukleosidhydrolase NSH3 fehlen, interessante Erkentnisse gewonnen werden. So zeigten diese Mutanten eine deutliche Akkumulation von Adenosin und Uridin im Apoplasten. Diese Nukleosidakkumulation war begleitet von einer reduzierten Photosyntheseeffizienz sowie einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber dem nekrotrophen Pathogen Botrytis cinerea. Durch umfangreiche Quantifizierungen relevanter Metabolite sowie durch Expressionsstudien photosynthese- und pathogenbezogener Gene konnten wir purinerges „Signalling“ als mögliche Ursache der beobachteten Veränderungen in ENT3:NSH3 Mutanten ausmachen. In einem weiteren Projektteil konnten wir kleine RNAs aus hochreinen, isolierten Gerste u. Arabidopsis-Vakuolen reinigen. Nach Klonierung und Hochdurchsatzsequenzierung mittels Illumina Technologie war eine Quantifizierungen dieser kleinen, im Mittel ca. 100 bp großen RNAs möglich. Dabei verteilte sich die RNA aus jungen Wildtyppflanzen zu 73% auf mRNAs, 24% auf ribosomale (vorwiegend cytosolisch) RNAs sowie 2,5% tRNA. Sehr wahrscheinlich gelangen diese RNAs durch Autophagocytose in die Vakuole, werden dort bis auf Ebene des Nukeosids abgebaut und bis zur weiteren Verwendung im Salvage-Pathway in der Vakuole gelagert.
Publications
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(2012) De novo pyrimidine nucleotide synthesis mainly locates outside of plastids, but a novel nucleobase importer provides substrates for the essential salvage pathway. Plant Cell, 24: 1549-1559
Witz S, Jung B, Fürst S, Möhlmann T
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(2014) Biochemical characterization and structure-function relationship of two plant NCS2 proteins, the nucleobase transporters NAT3 and NAT12 from Arabidopsis thaliana. BBA Biomembranes, 1838: 3025-3035
Niopek-Witz S, Deppe J, Lemieux MJ, Möhlmann T
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(2014) Nucleobase and nucleoside transport and integration into plant metabolism. Review, Front. Plant Sci.
Girke C, Daumann D, Niopek-Witz S, Möhlmann T
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(2014) Structure-function relationship of a plant NCS1 member - homology modeling and mutagenesis identified residues critical for substrate specificity of PLUTO a nucleobase transporter from Arabidopsis. Plos One
Witz S, Panwar P, Schober M, Deppe J, Pasha FA, Lemieux MJ, Möhlmann T
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(2015) Apoplastic nucleoside accumulation in Arabidopsis leads to reduced photosynthetic performance and increased susceptibility against Botrytis cinerea. Front. Plant Sci., 6: 1158
Daumann M, Fischer M, Niopek-Witz S, Girke C, Möhlmann T
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(2015) High yield expression and purification of equilibrative nucleoside transporter 7 (ENT7) from Arabidopsis thaliana. BBA General Subjects, 1850: 1921-1929
Girke C, Arutyunova E, Syed M, Traub M, Möhlmann T, Lemieux MJ
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Botrytis cinerea can import and utilize nucleosides in salvage and catabolism and BcENT functions as high affinity nucleoside transporter. Fun. Bio., Volume 120, Issue 8, August 2016, Pages 904-916
Daumann M, Golfier P, Knüppel N, Hahn M, Möhlmann T
