Concerted transcriptional and post-transcriptional control of Bacillus Phytase gene by the regulator proteins PhoP, AbrB, and CcpA
Final Report Abstract
Bodenbakterien wie Bacillus subtilis unterliegen permanenten Veränderungen der Umweltbedingungen. Deshalb muss die Zelle schnell über eine passende Antwort auf den Umweltstress entscheiden können, was durch unterschiedliche Transkriptionsregulatoren bewerkstelligt wird. Das phyC-Gen, das für ein extrazelluläres degradatives Enzym kodiert, wird dabei durch drei verschiedene Regulatoren kontrolliert: i) es unterliegt einer dualen Kontrolle durch den Phosphatmangen-induzierbaren Responseregulator PhoP, ii) es wird durch den globalen Regulator AbrB gehemmt, iii) dar Katabolitrepressor CcpA hat einen, wahrscheinlich posttranskriptionellen, positiven Effekt. Im Rahmen des Projektes wurden die regulatorischen Mechanismen, die der phyC-Expression zu Grunde liegen, untersucht. Die gesetzten Ziele konnten größtenteils erfüllt werden. So wurden die Bindungsstellen für AbrB innerhalb der phyC-Region determiniert und die kinetischen und thermodynamischen Parameter der phyC-AbrB- Bindung bestimmt. Aus diesen konnten ein kooperativer Bindungsmechanismus und die Stoichiometrie von 1 AbrB-Tetramer zu 2 DNA-Oligonukleotiden abgeleitet werden. Die Rolle von AbbA, als AbrB-Antirepressor, bei der phyC- Regulation wurde ebenfalls mit kinetischen Daten belegt. Ferner konnte experimentell zeigt werden, dass sowohl DNA als auch AbbA zu gleichen Konformationsänderungen im AbrB-Protein führen, was darauf schließen lässt, dass AbbA ein Kompetitor der DNA-Bindung ist. In weiteren Versuchen wurde durch gezielte Aminosäurenaustausche die Funktion der C-terminalen Domäne von AbrB auf die DNA-Bindung untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass Austausche von geladenen oder hydrophilen AS-Resten die Bindungsaffinität des Proteins stark beeinflussen, womit der C-Terminus von AbrB, entgegengesetzt der gängigen Meinung, eine entscheidende Rolle für die Protein-DNA-Interaktion spielt. Ein weiterer Schwerpunkt des Projektes war die Aufklärung der bislang unbekannten Proteinstrukturen von AbrB und AbbA, sowie dessen Komplexes und des AbrB-DNA- Komplexes. Dazu wurde eng mit dem EMBL (Hamburg) und dem ILL (Grenoble) zusammen gearbeitet. Dank dieser Kooperation konnten wir die Strukturen von AbrB und AbbA ermitteln. Diese spiegeln gut die biochemischen und molekularen Analysedaten wieder und werfen interessante Einblicke in die Funktionsweise von AbrB-ähnlichen Proteinen (wie Abh und SpoVT), die bislang nicht vollständig verstanden waren.
Publications
- (2008) Transition state regulator AbrB inhibits transcription of Bacillus amyloliquefaciens FZB45 phytase through binding at two distinct sites located within the extended phyC-promoter region. Journal of Bacteriology, Vol. 190(19):6467-74
Oliwia Makarewicz, Svetlana Neubauer, Corinna Preusse and Rainer Borriss
- (2012) Thermodynamic and molecular analysis of the AbrB-binding sites within the phyC-region of Bacillus amyloliquefaciens FZB45. Mol Genet Genomics, Vol. 287(2):111-22
Svetlana Neubauer, Rainer Borriss and Oliwia Makarewicz
(See online at https://doi.org/10.1007/s00438-011-0666-4)
