Live Cell Imaging System
Final Report Abstract
Abgeschlossene Projekte: 1. Im Rahmen der Charakterisierung eines Proteininteraktionsnetzwerks wurde die Lokalisation der Map-Kinase-Kinase-Kinase Bck1p und weiterer Proteinkinasen während verschiedener Zellzyklusstadien untersucht. Es konnte durch Ko- Lokalisation mit fluoreszierenden Markern der Mitochondrien gezeigt werden, dass BCK1 während aller Zellzyklusstadien an den Mitochondrien assoziiert vorliegt und in Zellen mit kleiner Knospe noch zusätzlich an der Knospenspitze. 2. Der Osmosensor Sho1p wurde als neues Mitglied eines Proteinkomplexes (HICS- Komplex) identifiziert, der an der Zytokinese von Hefezellen beteiligt ist. Time-lapse Analysen von Zellen die unterschiedlich fluoreszenz-markierte Proteine des HICS- Komplexes exprimierten, erlaubten die Reihenfolge festzulegen, in der die unterschiedlichen Mitglieder des Komplexes an der Stelle der Zelltrennung erscheinen. Laufende Projekte: 1. Wir etablieren eine Modifikation des Split-Ubiquitin Systems mit dem die zeitliche und örtliche Analyse von Proteininteraktionen gemessen werden kann. Hierbei wird die Verteilung von rot- und grün-fluoreszierenden Proteinen zeit- und ortsauflösend in lebenden Zellen mit dem Fluoreszenzmikroskop erfasst. 2. Die Septine bilden eine neue Klasse von Zytoskelettproteinen, die in der Hefe polares Wachstum und Zytokinese organisieren. Durch FRAP-Analysen von GFP-Fusionen Septin-bindender Proteine ermitteln wir die in vivo Dissoziationsraten dieser Proteine und vergleichen diese mit den in vitro gemessenen Bindungskinetiken. Durch FRAP Analysen der GFP-markierten Septine in Zellen, bei denen bestimmte Septinbindende Proteine ausgeschaltet wurden, ermitteln wir deren Einfluss auf die Dynamik und Stabilität des Septin-Zytoskeletts. 3. Mit Hilfe der TIRF-Mikroskopie untersuchen wir während des Zellzyklus die Verteilung von Proteinen, die unterhalb der Plasmamembran zu einem dicht gewobenen Netzwerk von Proteinen mit sehr unterschiedlichen Aktivitäten zusammengeschlossen sind. Diese Untersuchungen sollen helfen, den Einfluss dieses Netzwerks auf polares Wachstum und Sekretion zu charakterisieren. 4. Durch spezifische Oberflächenmarkierungen mit fluoreszierenden Farbstoffen versuchen wir ein Verfahren zu etablieren, mit dem Sekretion über Fluoreszenzmikroskopie in Einzelzellen in Echtzeit gemessen werden kann. 5. Zeitverlauf und Symmetrie der Kontraktion des Aktin-Myosin-Rings sind sehr sensitive Kenngrößen für den Verlauf der Zytokinese in der Hefe. Mit der Hilfe eines GFP-markierten Myosins können wir beide Parameter durch schnelle Abfolgen von fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen ermitteln und so den Einfluss bestimmter Mutanten auf die Zytokinese quantitativ erfassen.
Publications
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A constraint network of interactions: Protein Protein-protein interaction analysis of the yeast type II phosphatase Ptc1p and its adaptor protein Nbp2p. J Cell Sci. 124, 35-46 (2011)
Hruby, A., Zapatka, M., Heucke, S., Rieger, L., Wu, Y., Nussbaumer, U., Timmermann, S., Dünkler, A., and Johnsson, N
