ESI-Q-TOF Hybrid-Massenspektrometer
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Massenspektrometer wurde in erster Linie für dien Analyse von Wasserstoff-1H/2H- Austauschexperimente eingesetzt. Im ersten Projekt wurde der Wirkmechanismus des molekularen Chaperons Hsp90 und seiner Co-Chaperone CHIP, Sti1, Sba1 und Aha1 untersucht. Der Vergleich von E. coli Hsp90 mit Hsp90 der Hefe und des Menschen ergab überraschende Unterschiede, die zur Hypothese führten, dass eukaryotische Hsp90 Proteine probabilistische Maschinen sind, bei denen Nukleotidbindung nur die Wahrscheinlichkeit für bestimmte Konformationszustände verändert, während E. coli Hsp90 eine deterministische Maschine ist, bei der Nukleotidbindung eine definierte Änderung von Konformationen induziert. Wir konnten ferner die Interaktion der Co-Chaperone Sti1, Sba1 und Aha1 mit Hsp90 auf konformationeller Ebene charakterisieren. Außerdem wurde das Hsp70/Hsp90 Co-Chaperone CHIP, welches als E3 Ubiquitinligase das Chaperonsystem mit dem proteasomalen Degradationssystem verbindet, charakterisiert und wir konnten Kontroversen über die Symmetrie dieses dimeren Proteinkomplexes auflösen. Im zweiten Projekt wurde die konformationelle Dynamic des Tumorsuppressors p53 und dessen Interaktion mit Chaperonen untersucht. In der Mehrzahl der Tumoren ist p53 mutiert und die überwiegende Mehrzahl dieser Mutationen findet man in dessen DNA-Bindedomäne. Zunächst haben wir die Dynamik von Wildtyp-p53 und der häufigsten in Tumoren gefunden Varianten p53-R175H untersucht und konnten die destabilisierende Wirkung dieser Mutation auf verschiedene Strukturelemente lokalisieren. Wir konnten dann zeigen, dass die beiden häufigsten zellulären Hsp70-Chaperone, das konstitutive Hsc70 und das Hitze-induzierte Hsp70, ganz unterschiedliche Einflüssen auf Wildtyp- und Mutanten-p53 DNA- Bindedomäne haben. Im dritten Projekt wurde der eukaryotische Hitzeschocktranskriptionsfaktor HSF1 untersucht. Wir konnten zeigen, das HSF1 ein Thermosensor ist, welcher in vitro bei deutlich niedriger Temperatur aktiviert wird als in vivo. Gegenwärtig versuchen wir die Gründe für diese Unterschiede herauszufinden. Diese Vorarbeiten führten zur Formulierung eines neuen Projektes im Rahmen des neu-gegründeten SFBs „Cellular Surveillance and damage response“. Außerdem wurde dieses Gerät noch in einer ganzen Reihe von Kooperationsprojekten mit in- und ausländischen universitären Gruppen eingesetzt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Hsp90 charged-linker truncation reverses the functional consequences of weakened hydrophobic contacts in the N domain. Nature Struc. Mol. Biol. (2009) 16:1141-1147
S. Tsutsumi, M. Mollapour, C. Graf, C-T- Lee, B. T. Scroogins, W. Xu, L. Haslerova, M. Hessling, A. A. Konstantinova, J. B. Trepel, B. Panaretou, J. Buchner, M. P. Mayer, C. Prodromou, L. Neckers
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Insights into the conformational dynamics oft he E3 Ubiquitin Ligase CHIP in complex with chaperones and E2 enzymes. Biochemistry (2010) 49:2121-2129
C. Graf, M. Stankiewicz, R. Nikolay, M.P. Mayer
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Charged linker sequence modulates eukaryotic heat schock protein 90 (Hsp90) chaperone activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2012) 109:2937-2942
S. Tsutsumi, M. Mollapour, C. Prodromou, C-T- Lee, B. Panaretou, S. Yoshida, M. P. Mayer, L. Neckers
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Cross-Monomer Substrate contacts reposition the Hsp90 N-terminal domain and prime the chaperone activity. J. Mol. Biol. (2012) 415:3-15
T.O. Street, L.A. Lavery, K.A. Verba, C-T. Lee, M.P. Mayer, D.A. Agard
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Dynamics of the regulation of Hsp90 by the co-chaperone Sti1. EMBO J. (2012) 31:1518-1528
C-T. Lee, C. Graf, F.J. Mayer, S.M. Richter, M.P. Mayer
