Technology development and application for studying metabolism of extracellular and intracellular pathogens under real-time controlled culture conditions
Final Report Abstract
Es wurde eine Anlage entwickelt, mit der bis zu fünf Proben pro Sekunde aus einem Bioreaktor entnommen und innerhalb einer Sekunde durch eine Quenchinglösung auf unter -10°C gekühlt werden können um enzymatische Reaktionen zu stoppen. Diese Anlage ist für die Verarbeitung von Mikroorganismen (hier Pathogene) ausgelegt. Durch die Automatisierung dieses Probennahmevorgangs ist es möglich, eine sehr hohe Reproduzierbarkeit hinsichtlich Probenvolumen und Probennahmezeitpunkt zu erreichen. Weiterhin kann durch die Integration einer Methode zur Schnellfiltration von Fermentationsbrühe in diese automatische Probennahme eine zuverlässige Trennung von intra- und extrazellulärem Metabolom der Pathogenen erreicht werden. Größere Überraschungen, die zu einer Zeitverzögerung führten, waren die Instabilität der Abfüllmechanik, sowie der enorme Aufwand der nötig war, um mit dem Quenchingvorgang eine Abkühlung der Proben auf unter -10°C zu erreichen. Beide Probleme konnten jedoch behoben werden. Überraschend positiv ist die hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit, die durch die Automatisierung des Probennahmevorgangs erreicht werden kann. Dies übertrifft die ursprünglichen Erwartungen. Um neben den extrazellulär vorliegenden Pathogenen auch infizierte Wirtszellen verarbeiten und die verschiedenen Metabolitenpools (Wirt, Pathogen, Medium) aufschlüsseln zu können, wurde neben der Rapid Sampling Unit (RSU) eine mikrofluidische Probenverarbeitung (µSP) entwickelt. In dieser wurde eine schnelle Durchmischung der Zellsuspension in einem Mikromischer sowie der schnelle mikromechanische Zellaufschluss realisiert. Dabei wurden mehrere Probleme identifiziert, welche bisher nicht vollständig gelöst werden konnten. Durch die Freisetzung von Chromatin aus beschädigten Zellen wurde die Funktionalität der Mikromodule für den Zellaufschluss eingeschränkt und eine Abtrennung der Wirtszellen oder Pathogenen vom Kultivierungsmedium in den Separationsmodulen verhindert. Eine Modellierung des Zellaufschlusses lieferte wertvolle Ergebnisse auch im Hinblick auf die zukünftige Auslegung mikrofluidischer Systeme, in denen eine möglichst zellschonende Probenverarbeitung stattfinden soll. Durch die Arbeit mit realen Zellproben hat sich gezeigt, welche Probleme bei der Integration mehrerer Funktionen in einem einzelnen Mikrosystem auftreten und dass ein hohes Maß an Robustheit dieser Systeme erforderlich ist. Eine direkte Integration dieser Technologie (RSU + µSP) in ein vollständiges Gesamtsystem ist aufgrund der unterschiedlichen Anforderung hinsichtlich der Volumenströme bisher nicht gelungen. Bisher sind die makroskopische Probennahme und die mikroskopische Probenverarbeitung als getrennte Systeme zu betrachten, welche jedoch in Kombination wertvolle Ergebnisse über den wirtsadaptierten Stoffwechsel von Krankheitserregern liefern können.
Publications
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(2010). Microtechnology meets sy tems biology: The small molecules of metabolome as next big targets. Journal of Biotechnology, 149(1-2):33-51
Wurm M, Schoepke B, Lutz D, Mueller J and Zeng AP
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(2011). Mechanical disruption of mammalian cells in a microfluidic system and its numerical analysis based on computational fluid dynamics. Lab-on-Chip. 12(6), 1071-1077
Wurm M and Zeng AP
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(2012). Estimation of protein and metabolite release rates from damaged mammalian cells by using GFP as a marker molecule. Metabolomics
Wurm M
