American Foulbrood of Honey Bees: Analysis of the Molecular Pathogenesis
Final Report Abstract
Durch die Fortführung des Projekts sollten die Interaktionen zwischen dem Pathogen P. larvae und dem Wirt, den Bienenlarven, sowie die Pathomechanismen, die für den Infektionsverlauf und für die genotypspezifischen Unterschiede im Infektionsverlauf verantwortlich sind, auf molekularer Ebene analysiert werden. Konkret hatten wir uns folgende Aufgaben gestellt: (i) Die in der ersten Projektphase identifizierten Virulenzfaktoren, die Toxine Plx1 und Plx2, das S-layer-Protein SplA, das Chitin-abbauende Enzym PlCBP49, und die Sekundärmetabolite sollten weiter funktionell charakterisiert werden. (ii) Die Immunantwort der Larven auf Infektionen mit den Genotypen ERIC I und ERIC II sowie auf ausgesuchte Mutanten sollte umfassend analysiert werden. Bei der Bearbeitung dieser Fragen konnten wir auf unsere eigenen Vorarbeiten zurückgreifen: Expositionsbioassays mit Larven und P. larvae gehören bei uns zur Routine, die annotierten Genomsequenzen von beiden Genotypen liegen inzwischen vor und Protokolle zur genetischen Manipulation von P. larvae sind etabliert. Die notwendige Expertise zur Bearbeitung neuer Themenfelder haben wir uns über Kooperationen mit (i) Prof. Gustav Vaaje-Kolstadt (PlCBP49: Biochemie des Chitinabbaus), (ii) Prof. Rod Merrill (Toxine: Enzymkinetik und Kristallstrukturen) und (iii) Prof. Roderich Süßmuth (Sekundärmetabolite: Naturstoffchemie) erschlossen. In der zurückliegenden Projektphase haben wir kolloidales Chitin als Substrat für PlCBP49 und den postulierten oxidativen Reaktionsmechanismus von PlCBP49 bestätigt. Wir haben uns weiter mit den Sekundärmetaboliten (nicht-ribosomale Peptide, NRP; Polyketide, PK) von P. larvae befasst und gezeigt, dass ein für P. larvae ERIC II spezifisches NRPS/PKS-Cluster für die biosynthetische Maschinerie zur Herstellung eines Iturin-ähnlichen Lipopeptids, des Paenilarvins, kodiert. Von Sood und Mitarbeitern (2014) war postuliert worden, dass Paenilarvin als Toxin wirkt und ein Virulenzfaktor ist. Im Expositionsbioassay zeigte sich aber, dass die Geninaktivierungsmutante für das Paenilarvin- Gencluster (DSM25430 Δitu) unvermindert virulent war im Vergleich zum entsprechenden Wildtyp- Stamm. In Zellkulturassays war aufgereinigtes Paenilarvin nicht zytotoxisch gegenüber Insektenzellen. In Larvenassays hatte das Verfüttern von Paenilarvin keine toxische Wirkung auf die Larven. Paenilarvine sind daher keine Toxine und auch keine Virulenzfaktoren von P. larvae ERIC II während der invasiven Phase der Pathogenese. Allerdings zeigte DSM25430 Δitu ein gegenüber dem Wildtyp verzögertes Schwärmverhalten. Die Paenilarvine scheinen daher ähnlich wie die Iturine und Surfactine grenzflächenaktiv zu sein und die Motilität von schwärmenden Bakterien zu erleichtern. Wir konnten außerdem erstmals zeigen, dass P. larvae Biofilme bildet, allerdings spielten die Paenilarvine keine Rolle bei dieser Art des kollektiven Verhaltens von P. larvae. Das Schwärmen von P. larvae ERIC II und die Biofilmbildung bei beiden P. larvae Genotypen sollen Gegenstand weiterer Forschungsarbeiten sein. Die Untersuchungen zu Plx2A ergaben, dass Plx2A eine ADP- Ribosyltransferase mit RhoA als intrazellulärem Zielmolekül ist. Die konservierten Motive QXE (pos. 166-168, katalytisches Zentrum) und STS (pos. 128-130, NAD+ Bindung) sowie das konservierte Arginin (pos. 83, NAD+ Bindung) sind entscheidend für die Ribosylierung von RhoA. Plx2A war zytotoxisch gegenüber Hefezellen, bewirkte bei kultivierten Mausmakrophagen eine Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts und bei Insektenzellen eine Inhibition der Zytokinese. Die Wirkung von Plx2a auf Insekten-/Bienenzellen soll Gegenstand weiterer Forschungsarbeiten sein. Wir haben uns erstmals auch den Auswirkungen von P. larvae-Infektionen auf Larven gewidmet und gezeigt, dass die Immunantwort der Larven vom Genotyp des infizierenden P. larvae-Stamms abhing. In P. larvae ERIC II infizierten Larven wurden signifikant mehr Gene dereguliert, als dies bei P. larvae ERIC I- infizierten Larven der Fall war. Als Reaktion auf eine Infektion mit P. larvae ERIC II wurden die antimikrobiellen Peptide Abaecin, Apidaecin, Defensin-1 und Hymenoptaecin hochreguliert, während als Reaktion auf P. larvae ERIC I-Infektionen nur Defensin-1 und Hymenoptaecin hochreguliert wurden. Dieses faszinierende Ergebnis, dass die innate immunity der Bienenlarven differentiell auf unterschiedliche Genotypen derselben infizierenden Bakterien-Spezies reagiert, soll Gegenstand weiterer Forschungsarbeiten sein, da die Untersuchung einer ko-evolvierten Wirt-Pathogen-Beziehung offensichtlich bisher ungeahnte Einblicke in die Funktionsweise der innate immunity von Insekten ermöglicht.
Publications
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Biological role of paenilarvins, iturin-1 like lipopeptide secondary metabolites produced by the honey bee pathogen Paenibacillus larvae. PLoS ONE 11(10): e0164656 (2016)
Hertlein G, Seiffert M, Gensel S, Garcia-Gonzalez E, Ebeling J, Skobalj R, Kuthning A, Süßmuth RD, Genersch E
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Biology of Paenibacillus larvae, a deadly pathogen of honey bee larvae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 100: 7387-7395 (2016)
Ebeling J, Knispel H, Hertlein G, Fünfhaus A, Genersch E
