Systematic shRNA and siRNA screens to investigate drug resistance in human leukemia

• Applicant: Professor Dr. Martin Eilers
• Subject Area: Hematology, Oncology
• Term: from 2008 to 2013
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 59021035

Dieses Z-Projekt hat zwei Ziele: Erstens stellt es der Klinischen Forschergruppe zurzeit in unserer Gruppe verfügbare shRNA- und siRNA-abhängige Screening-Technologien zur Verfügung. Diese Screens basieren auf zwei komplexen sh(short hairpin)-RNA beziehungsweise siRNA Bibliotheken. Die erste Bibliothek ist am NKI von der Gruppe von Rene Bernards konstruiert worden und enthält annähernd 24,000 shRNA Vektoren, die gegen 8,000 humane Gene gerichtet sind. Die zweite „Bibliothek" ist eine kommerzielle siRNA-Sammlung mit insgesamt 23,000 einzelnen siRNA Oligonukleotidpools; aus dieser Bibliothek haben wir bereits Subbibliotheken, die gegen alle humanen Kinasen und alle humanen Ubiquitin-Ligasen enthalten, erstellt. Innerhalb der klinischen Forschergruppe werden wir entsprechend eine siRNA-Bibliothek, die gegen alle DNA-Reparatur- und Checkpointproteine gerichtet ist, erstellen. Diese Bibliotheken sind bereits mit mehreren Technologien durchsucht werden. Zum Beispiel haben wir mehrere Screens, die auf Immunfluoreszenz-Methoden basieren, mit Hilfe automatisierter, konfokaler Mikroskopie durchgeführt. Das zweite Ziel dieses Projektes besteht darin, Technologien zu adaptieren, die es erlauben, nach Genen zu suchen, die für das Wachstum von leukämischen Stammzellen und die Entwicklung von Chemoresistenz essentiell sind. Dazu werden wir Techniken adaptieren, die es erlauben, die Frequenz individueller shRNA Vektoren in komplexen Mischungen solcher Vektoren zu bestimmen. Wir werden dann leukämische Zellen mit Mischungen lentiviraler Vektoren, die jeweils eine shRNA gegen ein Gen exprimieren, infizieren, und die Zellen in et al., 2006). Such screens are fairly easy when they are performed in adherent cells and are limited to gene families hat contain up to 1-2000 members, since they can then be pipetted An alternative is to use retroviral or lentiviral libraries. One major advantage is that this klonocienen Assays und in Gegenwart von chemotherapeutischen Substanzen ausplattieren; langfristig ist geplant, infizierte Zellen zu in Scid-Mäuse zu transplantieren und therapienahe Protokolle durchzuführen. Anschließend werden wir bestimmen, für und gegen welche shRNA Vektoren während dieser Prozesse selektiert wird und daraus Rückschlüsse auf • diejenigen Gene ziehen, die für jeden Prozess notwendig sind. Ziel der ersten Förderperiode ist es, einen „proof-of-principle" zu erhalten, der zeigt, dass es möglich ist, mit diesem Ansatz • Resistenzphänomene in Leukämiezellen zu analysieren.

• DFG Programme: Clinical Research Units
• Subproject of: KFO 210: Genetics of Drug Resistance in Cancer