Identifikation früher Methylierungsereignisse in der Pathogenese akuter myeloischer Leukämien
Final Report Abstract
Zielstellung des vorliegenden Projektes war die Charakterisierung der zeitlichen Abläufe der Entstehung, Lokalisation und Verteilung sowie Ausbreitung von hypermethylierten Arealen in der Genese akuter myeloischer Leukämien am Modell der PU.1-kd-Maus. Im Rahmen dieses Projektes wurden zum einen grundlegende methodische Fortschritte in der genomweiten und Kandidaten-basierten Methylierungsanalyse erzielt sowie umfangreiche Charakterisierungen der Methylierungsereignisse im PU.1-kd-Mausmodell vorgenommen. Im folgenden sind die wesentlichen wissenschaftlichen Fortschritte aufgeführt. Insbesondere bei den hochauflösenden quantitativen Methylierungsanalysen wurden neue Erkenntnisse hinsichtlich der Überlegenheit gegenüber konventionellen, etablierten DNA-Methylierungsmessungen (wie z. B. MSP, CoBRA etc.) erreicht. Wir konnten die Notwendigkeit hochauflösender quantitativer Methoden in der epigenetischen Charakterisierung von Kandidatengenen demonstrieren insbesondere vor dem Hintergrund der Korrelation mit molekularen bzw. phänotypischen Endpunkten. In vergleichenden Untersuchungen quantitativer hochauflösender mit nicht-quantitativen Methoden konnte systematische Fehler identifiziert und charakterisiert werden und Korrekturmöglichkeiten getestet werden. Wir konnten zeigen, dass systematische Fehler quantitativer Messungen mittels Regressionsanalysen beschrieben und korrigiert werden können. Entsprechende Bioinformatische Werkzeuge wurden entwickelt und sind frei verfügbar. Im murinen AML-Modell (PU.1-kd) konnte erstmal gezeigt werdem, dass veschiedene Stadien der Leukämogenese durch spezifische DNA-Methylierungsprofile charakterisiert sind. Während in den früheren Stadien der Erkrankung aberrante Methylierung zwar vorliegt, jedoch vergleichsweise stabil ist, kommt es im finalen Stadium der Erkrankung zu ausgeprägten komplexen Veränderungen mit betonter Diversifikation der individuellen Knochenmarksproben. Wir konnten zeigen, dass an sehr frühen Zeitpunkten der AML-Pathogenese selbst ohne nachweisbare Blastenpopulation im Knochenmark (im Menschen am ehesten mit präleukämischen Stadien wie z. B. MDS gleichzusetzen) bereits ausgedehnte Methylierungsveränderungen in spezifischen Genregionen bestehen. Hypermethylierung lag in den untersuchten Regionen deutlich häufiger vor als Hypomethylierung. Die Anzahl der hypermethylierten Genregionen im präleukämischen Stadium (810 rekurrente Genregionen insgesamt, davon 187 konstant auch über die folgenden Stadien hinweg) übertrifft bei weitem die Zahl der bekannten genetischen Ereignisse (z. B. Mutationen) zu diesen frühen Zeitpunkten. Viele der früh aberrant methylierten Genregionen im Mausmodell zeigten auch aberrante Methylierung in humanen AML- oder MDS-Proben. Darunter befanden sich auch einige Gene mit bereits nachgewiesener Relevanz in der humanen AML-Pathogenese (z. B. CEBPA, Mitglieder des WNT-Signaltransduktionsweges). Dies demonstriert die Relevanz dieses Mausmodells für Untersuchung epigenetischer Veränderungen vor dem Hintergrund humaner AML- oder MDS-Erkrankungen. Mitglieder des WNT-Signaltransduktionswegs, dessen Relevanz für AML- und MDS- Pathogenese bereits in vorhergehenden Arbeiten beschrieben wurde, waren als Zielstrukturen aberranter Methylierung zu den frühen Zeitpunkten der murinen AML- Pathogenese deutlich überrepräsentiert. Erste Untersuchungen deuten darauf hin, dass die räumliche und zeitliche Ausbreitung aberranter Methylierung im PU.1-kd-Mausmodell Regelmäßigkeiten bzw. Mustern unterliegt. Ausgedehnte Hypermethylierung zu späteren Zeitpunkten konnte vor allem in den Regionen detektiert werdem, in denen vereinzelte Methylierungsereignisse bereits zu sehr frühen Zeipunkten der murinen AML-Pathogenese vorlagen (Konzept der "seeding regions". Als "überraschend" bzw. eher den experimentellen Ablauf des Projektes beeinflussend stellte sich dar, dass aufgrund der erheblichen Dynamik der technischen Weiterentwicklungen in diesem Forschungsfeld die methodischen Strategien zunächst angepasst und etabliert werden mussten. Insbesondere die Etablierung und Optimierung neuer genomweiter Techniken (hier MCIp) und quantitativer Methylierungsanalysen stellte einen großen und wichtigen Teil des ersten Förderungsjahres dar.
Publications
- The DNA methyltransferase inhibitors azacitidine, decitabine and zebularine exert differential effects on cancer gene expression in acute myeloid leukemia cells. Leukemia. 2009 Jun;23(6):1019-28
Flotho C, Claus R, Batz C, Schneider M, Sandrock I, Ihde S, Plass C, Niemeyer CM, Lübbert M
- DNA methylation profiling in acute myeloid leukemia – recent technological advances and biological/clinical insights. Future Oncology. 2010;6(9):1415-31
Claus R, Plass C, Armstrong SA, Bullinger L
- Quantitative analyses of DAPK1 methylation in AML and MDS. Int J Cancer. 2011 Sep 14. [Epub ahead of print]
Claus R, Hackanson B, Poetsch AR, Zucknick M, Sonnet M, Blagitko-Dorfs N, Hiller J, Wilop S, Brümmendorf TH, Galm O, Platzbecker U, Byrd JC, Döhner K, Döhner H, Lübbert M, Plass C
- A systematic comparison of quantitative high-resolution DNA methylation analysis and methylation-specific PCR. Epigenetics. 2012 Jul 1;7(7)
Claus R, Wilop S, Hielscher T, Sonnet M, Dahl E, Galm O, Jost E, Plass C
(See online at https://doi.org/10.4161/epi.20299)
