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Projekt
TALE-basierte Dekodierung von 5-Hydroxymethylcytosine durch Selektive Modifikationsantwort
Antragsteller
Professor Dr. Daniel Summerer
Fachliche Zuordnung
Biologische und Biomimetische Chemie
Förderung
Förderung von 2015 bis 2020
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 277439993
5-Methylcytosin (mC) ist ein zentrales regulatorisches Element der Genexpression. Kürzlich wurde entdeckt, das Ten-Eleven-Translokation (TET) Proteine mC zu 5-Hydroxymethylcytosin (hmC), 5-Formylcytosine (fC) und 5-Carboxycytosine (caC) oxidieren können, von denen die beiden letzteren mittels Reparatur durch C ersetzt werden können. Dies stellt ein Modell für die aktive Demethylierung und somit für die dynamische epigenetische Modifikation von DNA dar, mit größter Bedeutung für die Regulation der Genexpression und für Krankheitsentwicklungen. Zudem wird hmC zunehmend als epigenetische Markierung an sich erkannt, da es anders mit epigenetischen Proteinen interagiert und einzigartige Verteilungen über Genome und Zelltypen aufweist. Die Entschlüsselung der biologischen Funktionen von hmC erfordert einfache und effektive Methoden, die sowohl lokale Muster (Typisierung), als auch breite Profile (Profilierung) in Genomen mit atomarer Auflösung analysieren können. Eine Beschränkung für die Entwicklung solcher Verfahren ist jedoch das lange bekannte Dilemma, dass nur kanonische, nicht aber epigenetische Nukleobasen programmierbar erkannt werden können (durch Watson-Crick-Hybridisierung). Deshalb sind aktuelle Verfahren für die hmC-Typisierung / Profilierung vergleichsweise kompliziert oder schlecht aufgelöst. Um dieses Dilemma zu überwinden, haben wir das Konzept der erweiterten Programmierbarkeit der DNA-Erkennung eingeführt. Dies basiert auf programmierbaren transcription-activator-like effectors (TALEs), die aus verketteten Wiederholungseinheiten (Repeats) mit individuellen Selektivitäten für die vier kanonischen Nukleobasen bestehen. Wir haben TALE Repeats identifiziert, die zusätzliche Selektivitäten für C, mC und hmC aufweisen. Dies ermöglichte uns, den ersten genomischen in vitro Test für einen direkten, programmierbaren Nachweis einzelner epigenetischer Nukleobasen auf Basis von TALE-DNA-Bindung zu entwickeln. In diesem Projekt werden wir diesen Ansatz durch das Konzept der selektiven Modifikationsantwort erweitern. Wir werden die selektive enzymatische Glucosylierung von hmC (zu beta-Glucosyl-hmC, ghmC) nutzen, um den Größenunterschied zwischen hmC und anderen Nukleobasen signifikant zu erhöhen. Wir werden zudem TALE Repeats konstruieren, die unspezifisch an C, mC, hmC, fC und caC binden, nicht jedoch an ghmC. Wir werden optimale Parameter für die Integration dieser TALE Repeats in vollständige TALEs definieren und hmC Typisierungs- / Profilierungstests auf Basis von Affinitätsanreicherung und qPCR entwickeln. Wir werden analytische Schlüsselparameter dieses Tests mit denen mehrerer aktueller Tests vergleichen. Dies wird einen einfachen und vollständig validierten Test zur Typisierung und Profilierung von hmC mit atomarer Auflösung, hoher Sequenzauflösung und quantitativer Level-Analyse ergeben, der neue Einsichten in die Rolle von hmC in der Genregulation in normalen und Krankheitsassoziierten Prozessen ermöglichen wird.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
