Identifizierung und funktionale Charakterisierung von Pseudouridin in Boten-RNAs und nicht-kodierenden RNAs des bakteriellen Humanpathogens Campylobacter jejuni

• Antragstellerin: Professorin Dr. Cynthia Mira Sharma
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie ; Biochemie ; Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2015 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 277446585

Mehr als 100 RNA-Modifizierungen sind in allen Domänen des Lebens beschrieben. Die meisten Modifizierungen kommen in abundanten RNAs wie rRNAs, tRNAs und snRNAs vor. Genomweite Studien haben jedoch vor kurzem auch Modifizierungen in mRNAs von Eukaryonten und Archaeen entdeckt. Modifizierungen in bakteriellen mRNAs sind bislang unbekannt. Hier möchten wir RNA-Modifizierungen in Campylobacter jejuni, dem derzeit häufigsten Erreger bakterieller Gastroenteritis, mit einem Fokus auf Pseudoduridin (PU) untersuchen. Dieses universell konservierte und häufigste modifizierte RNA-Nucleosid ist ein Isomer von Uridin und wird posttranskriptional durch Pseudouridinsynthasen (PUS) generiert. Mittels Pseudo-seq, einer neuen Methode zur globalen Detektion von PU basierend auf Hochdurchsatzsequenzierung von Abbruchprodukten einer reversen Transkription an chemisch-modifizierten PUs, wurden vor kurzem PUs in mRNAs von Mensch und Hefe nachgewiesen, wobei deren Funktion noch unklar ist. Ein Anstieg von PU unter Stress deutet auf eine Modulierung von RNA-Stabilität und -Struktur oder des genetischen Codes hin, da artifiziell eingefügte PUs zur Nonsense-Suppression führen können.Mittels genomweiten Ansätzen möchten wir eine globale Detektion von PU im Humanpathogen C. jejuni erzielen und die Funktion von PU in bakteriellen RNAs untersuchen. Unsere RNA-seq basierten Transkriptomstudien haben eine sehr kompakte Transkription und viele regulatorische RNAs in C. jejuni enthüllt. Dies deutet auf eine wichtige Rolle von posttranskriptionaler Genexpressionskontrolle hin. Mittels Co-Immunopräzipitation und RNA-seq (RIP-seq) zur globalen Analyse von RNA-Substraten der tRNA-modifizienden PUS TruB konnten wir tRNAs und auch mRNAs als potentielle Substrate von TruB identifizieren. Unsere erste Pseudo-seq-Analyse von C. jejuni Wildtyp (WT) RNA detektierte erfolgreich PU in tRNA und rRNA und lieferte auch mehrere mRNAs mit einem potentiellen PU. Durch eine Kombination von RIP-seq von PUS mit Pseudo-seq von WT und PUS-Mutantenstämmen unter Standard- und Stressbedingen werden wir eine globale Kartierung von PU und PUS-Konsensusmotiven in C. jejuni vornehmen. Die PU-Modifizierungen sollen durch Primer-Extension, in-vitro Bindestudien von PUS und Substrat-RNAs, sowie Detektion von PU in in-vitro modifizierten RNAs nach Inkubation mit aufgereinigten PUS mittels Chromatographie oder Massenspektrometrie validiert werden. Für eine spezifische Detektion oder Aufreinigung werden wir mittels kupferfreier Click-Chemie Biotin oder Fluorophore an PU in in-vitro modifizierten RNAs oder Gesamt-RNA koppeln. Mittels biochemischer, molekularbiologischer und genetischer Methoden werden wir die Funktionen von PU in bakteriellen mRNAs untersuchen. Für ausgewählte Kandidaten werden wir Änderungen in RNA-Stabilität, Struktur oder dem genetischen Code untersuchen. Die Untersuchung von PU in C. jejuni ermöglicht somit Einblicke in die posttranskriptionale Regulation durch RNA-Modifizierungen.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 1784: Chemische Biologie natürlicher Nukleinsäuremodifikationen