Untersuchung epigenetischer Regulation des RNA Polymerase II Transkriptionszyklus

• Antragsteller: Dr. Jan-Hendrik Spille
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung
• Förderung: Förderung von 2016 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 323110857

Genexpressionslevel bestimmen die Proteinzusammensetzung und damit den Phenotyp einer Zelle. Alle Zellen eines Organismus tragen die gleiche genetische Information in sich. Die Regulation der Genexpression bestimmt daher die Funktion einer Zelle. Fehlregulation kann zu Krankheit führen. Genexpression beginnt mit der Transkrition genetischer Information durch RNA Polymerase II (Pol II), die so für Proteintranslation verfügbar wird. Chromatinstruktur und -modifikationen sowie Bindung von Transkriptionsfaktoren tragen zur Transkiptionsregulation bei. Hier soll der Effekt von posttranslationalen Histonmodifikationen (PTM) untersucht warden. Die DNA ist eng um Histon-Oktamere gewickelt. Die Modifikation einzelner Aminosäuren, z.B. Acetylisierung oder Methylisierung, beeinflusst die DNA-Histon Wechselwirkung und kann Bindestellen für Transkriptionsfaktoren schaffen. PTM sind vererbbar und bilden ein epigenetisches Gedächtnis, das nicht im genetischen Code der DNA gespeichert ist. Spezifische PTM sind mit dem Transkriptionszustand eines Gens assoziiert. Vorläufige Daten zeigen, dass Pol II an aktiv transkribierten Genen transiente Cluster mit einer Lebensdauer von wenigen Sekunden bildet. Die Lebensdauer bestimmt die mRNA Produktion am betreffenden Genlokus. Unsere Daten zeigen außerdem, dass die Inhibition von Histondeacetylierung die durchschnittliche Clusterlebensdauer im Nukleus um eine Größenordnung verlängert. Ich werde den Effekt von PTM auf die Kinetik der Pol II Cluster und mRNA Synthese untersuchen. Klassische Methoden zur Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen und mRNA Expression liefern Ergebnisse für Populationen von chemisch fixierten Zellen und verschleiern Dynamiken und transiente Interaktionen. Fluoreszenmikroskopie kann diese Informationen zugänglich machen. Mit Hilfe von Lattice Light Sheet Mikroskopie (LLS) werde ich die Kinetik des Pol II Transkriptionszyklus mit hoher Zeitauflösung untersuchen. PTM am Ort von Pol II Clustern sollen mit Antikörperfragmenten und schneller Mehrkanalabbildung visualisiert werden. LLS wird eine detaillierte Untersuchung der Clusterformierung und -abbau, -lebensdauer und -größe, sowie des Anteils fest gebundener Pol II ermöglichen. Simultane mRNA Detektion an einzelnen Genen wird Variabilität in der deterministischen Beziehung zwischen Clusterlebensdauer und mRNA Produktion aufdecken. Dies hat wichtige Implikationen fuer stochastische Fluktuationen im Expressionslevel (transcriptional bursting). Um promotersspezifische Unterschiede aufzudecken und differentielle Genregulation durch global veränderte PTM-Level zu untersuchen, werde ich ein System zur gleichzeitigen Detektion vieler Genloci entwickeln. Schließlich werde ich gezielt PTM in der Promoterregion eines stillgeleten Gens einführen um es zu aktivieren und kinetische Aspekte der epigenetisch regulierten Genexpression zu entschlüsseln.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeber: Professor Dr. Ibrahim Cissé