Kryo-Elektronenmikroskopie der Replikativen Helikase

• Antragstellerin: Dr. Sarah Schneider
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2018 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 394139458

Während der eukaryotischen DNA-Replikation wird die replikative Helikase MCM2-7 auf doppelsträngige DNA (dsDNA) geladen, um einen prä-Replikationskomplex (Pre-RC) zu bilden, der als Plattform für den Aufbau der Replikationsgabel dient. Die effiziente und regulierte Assemblierung der Helikase an Chromatin ist für die DNA-Replikation essentiell, hat aber auch für die Genomstabilität, die Stammzellhomöostase, die Alterung und die Tumorentstehung eine hohe Relevanz. Die Konformationsänderungen von einem spiralförmigen MCM2-7-Ringkomplex zu einem perfekt geformten Ring mit eingeführter DNA und dem nachfolgenden DNA-Insertionsverfahren stellen die kritischen Schritte während des Zusammenbaus der Helikase dar, da dieser Prozess das Enzym physikalisch mit DNA verbindet. Allerdings sind die zugrundeliegenden Mechanismen dieser Reaktion völlig unbekannt. Mein Ziel ist es, Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zu verwenden, um die MCM2-7 Konformationsänderungen und das Umschließen der DNA auf atomarer Ebene zu verstehen. Ich werde dabei von der einzigartigen Expertise der Gruppe profitieren, die hocheffiziente in vitro MCM2-7-Komplex Rekonstitution-Protokolle entwickelt hat und die eine lange Erfolgsbilanz der Arbeit an der Schnittstelle von Biochemie und Elektronenmikroskopie vorweisen kann. So kann ich mich bereits auf die kürzlich gelöste 3.9 Å-Struktur des DNA-Helikase Komplex stützen um die Struktur des Helikase-Komplexes zu untersuchen, der unmittelbar vor der DNA-Insertion arretiert wurde. Weiterhin werde ich einen DNA-Helikase Komplex strukturell charakterisieren, dessen essentieller Cdt1 Replikationsfaktor basierend auf dem bekannten DNA-Helikase Komplex modifiziert wurde. Die Auflösung dieser Strukturen wird einen umfassenden mechanistischen Einblick in die kritischen strukturellen Konformationsänderungen liefern, die die eukaryotische Helikase während des Zusammenbaus der Helikase an Chromatin durchmacht. Wichtig ist, dass diese Arbeit ein Model für verwandte Prozesse der regulierten MCM2-7 Ringöffnung während der DNA-Synthese, DNA-Reparatur oder potenziell auch DNA-Rekombination liefert. Langfristig möchte ich dieses Wissen in das humane System umsetzen, da es mir erlaubt, einzigartige regulatorische Prinzipien der Formierung der humanen Helikase zu identifizieren, die für die genomische Stabilität sehr wichtig sind. Darüber hinaus könnte das strukturelle Wissen für die Entwicklung von molekulare Replikationsinhibitoren wichtig sein.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: Großbritannien
• Gastgeber: Professor Dr. Christian Speck