Funktionelle Charakterisierung von dynamischen Signalkomplexen der BRAF Kinase und deren Modulation durch tumorspezifische Mutationen und klinisch relevante Kinase-Inhibitoren

• Antragsteller: Professor Dr. Tilman Brummer
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Biochemie ; Hämatologie, Onkologie
• Förderung: Förderung von 2019 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 421542753

BRAF spielt eine zentrale Rolle bei der Aktivierung des RAS/ERK-Signalweges. Der Aktivierungszyklus dieser Kinase wird durch RAS-induzierte Homo- oder Heterodimerisierung, Protein-Protein-Wechselwirkungen und post-translationale Modifikationen (PTM) kontrolliert.In vielen Tumoren ist BRAF durch Mutationen dereguliert. Die häufigste Mutation, V600E, erzeugt einen Kurzschluss im noch unvollständig verstandenen BRAF-Aktivierungszyklus. Die BRAFV600E-Kinasedomäne befindet sich in einer Konformation, die von wildtypischem BRAF (BRAFWT) nur durch RAS-induzierte Aktivierung erreicht wird. Diese Erkenntnis führte zur Entwicklung von BRAFV600E-selektiven Inhibitoren, die z.T. beeindruckende Ansprechraten erzielen. Leider sind diese jedoch, durch das Auftreten von Resistenzen, oft kurzlebig. Die BRAF-Inhibitor induzierte, paradoxe Aktivierung des ERK Signalweges stellt einen häufigen Resistenzmechanismus dar. Dieses Phänomen wird durch die Eigenschaft von klinisch angewendeten, BRAF selektiven Inhibitoren verursacht, die die Ausbildung von Heterodimeren zwischen Inhibitor gebundenem BRAF und ungebundenen RAF Isoformen in RAS abhängiger Weise fördern. Hierbei wirkt inhibiertes BRAF als allosterischer Aktivator des Wirkstoff-freien RAF Protomers, wodurch ERK-Reaktivierung und Tumorwachstum begünstigt werden. Wahrscheinlich basiert die paradoxe Wirkung von BRAF-Inhibitoren auf Prozessen, die auch bei der physiologischen Aktivierung des Signalwegs auftreten. Insofern liefert die Aufklärung der räumlich-zeitlichen Dynamik von quaternären BRAF Komplexen im physiologischen wie pharmakologischen Kontext wichtige Beiträge zur Wirkstoffentwicklung.Unter Verwendung von Blue Native PAGE und SEC-PCP-SILAC basierter Massenspektrometrie (MS) konnten wir zeigen, dass BRAFWT und BRAFV600E Multiproteinkomplexe unterschiedlicher Größe und Zusammensetzung bilden. Zudem induzierte RAS BRAFWT-enthaltende Komplexe, deren Größe mit BRAFV600E Komplexen vergleichbar war. Interessanterweise, beeinflussen klinisch relevante Inhibitoren die Stabilität dieser Komplexe. Daher postulieren wir, dass der Aktivitätsstatus der Kinasedomäne die Anordnung von BRAF-Signalkomplexen bestimmt. In dem beantragten Projekt wollen wir diese Hypothese durch eine ausführliche Charakterisierung der Zusammensetzung und des PTM-Musters von BRAF-Komplexen, die unter physiologischen Bedingungen und in Gegenwart von Kinase-Inhibitoren mit (prä)klinischer Relevanz gebildet wurden, bestätigen. Wir werden unsere MS Protokolle mit neuartigen biochemischen Methoden kombinieren, um kurzlebige dynamische Interaktionen zu identifizieren. Unsere Studien sollen außerdem auf Komplexe von Nicht-V600E BRAF-Onkoproteinen ausgedehnt werden, die zunehmend durch Tumorsequenzierungen nachgewiesen werden und bisher kaum im Hinblick auf Ihre Wirkweise und Inhibitorempfindlichkeit charakterisiert sind. Hierdurch werden wir wichtige Informationen zum Pathomechanismus und zur pharmakologischen Blockade dieser Mutanten erhalten.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Schweiz
• Partnerorganisation: Schweizerischer Nationalfonds (SNF)
• Kooperationspartner: Professor Dr. Jörn Dengjel