Regulation und gating von neuen Aquaporinen aus dem Schleimpilz Dictyostelium disciodeum und deren Funktion für die Zellmotilität

• Antragsteller: Professor Dr. Eric Beitz
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2008 bis 2012
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 111328395

Wir haben ein neues Aquaporin, AqpB, aus Dictyostelium discoideum charakterisiert. AqpB ist wasserspezifisch, O-glykosyliert und besitzt einen neuen gating-Mechanismus. Es ist in vakuolären Strukturen, der Plasmamembran und in Membranausstülpungen lokalisiert. Es stellt das bislang einzige funktionelle Aquaporin in Dictyostelien dar und wird in allen Entwicklungsstadien exprimiert. Die kritische Domäne für das gating umfasst sieben Aminosäure-Positionen des D-loops. Knockout-Versuche ergaben bisher unspezifische Genomintegration. Neben AqpB haben wir auf cDNA- und Proteinebene die Expression eines zweiten Aquaporins, AqpC, in Amöben nachgewiesen. Nun wollen wir den molekularen Mechanismus des AqpB-gatings weiter aufklären und die physiologische Funktion schwerpunktmäßig des AqpB und ansatzweise des AqpC untersuchen. Wir führen gezielte Mutationen in AqpB ein, besonders im Bereich um das konservierte Tyrosin-218, zur biophysikalischen Funkionsanalyse. Wir stellen optimierte knockout-Konstrukte mit längeren Linkerarmen her bzw. wählen GC-reiche Sequenzen innerhalb des AqpB-kodierenden Bereichs, um die Spezifität der Integration zu erhöhen. Falls der knockout letal ist, werden wir die amber-suppression knockdown-Methode einsetzen, die die Proteinlevel um bis zu 90% reduziert. Durch dominante Überexpression von de-regulierten AqpB-Varianten werden wir die Funktion des gatings für die Zellphysiologie prüfen. Die Phänotypen der knockouts/knockdowns/Überexpressionskulturen analysieren wir im Hinblick auf Morphologie, Cytokinese, Entwicklung, Motilität, Volumenregulation und Makropinozytose. Wir erwarten grundlegende Erkenntnisse zur Beteiligung von Aquaporinen in der Zellphysiologie, die sich insbesondere auf motile humane Zellen (z.B. Immunzellen, metastasierende Tumorzellen) übertragen lassen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen